酶与酶制剂结课论文固定化酶及其在工业上的应用学生姓名周亚楠学号**********所属学院生命科学学院专业食品质量与安全班级13-2班指导教师宋丽军日期2013年4月塔里木大学教务处制固定化酶周亚楠（塔里木大学生命科学学院食品质量与安全13-2 7051209210）摘要：随着社会的发展，越来越多酶被人们广泛的应用在工业生产、生物传感器和环境保护等领域.研制开发性能优异的固定化载体,已成为固定化酶技术最为活跃的研究方向之一.固定化酶在生物及生物工程、环境化工、食品、医药等领域得以迅速发展,其中,结合现代分析仪器,固定化酶反应器(IMER)将成为固定化酶应用的一个新领域。

本文对近几年来回定化酶栽体的制备及固定化醇的应用进行了综述.关键词：酶；定化酶；应用；进展1固定化酶的定义固定化酶是指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并反复连续地进行有效催化反应的酶。

固定化酶又称固相酶。

在理论研究上，固定化酶可以作为探讨酶在体内作用的模型;在实际使用中,可使生产工艺自动化和连续化，提高酶的使用效率。

2固定化酶的发展历史固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。

酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。

与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。

固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。

3固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类3.1 物理方法包括物理吸附法、包埋法等。

物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。

但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。

3.1.1吸附法利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。

通常有物理吸附法和离子吸附法。

常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。

3.1.2载体结合法最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。

在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。

参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。

以中国首先采用的双功能团试剂“对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。

此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。

此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。

3.2化学方法包括结合法、交联法。

结合法又分为离子结合法和共价结合法。

是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.3.2.1交联法依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。

常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。

酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。

3.2.2包埋法酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。

包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。

酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如5′-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍（如青霉素酰化酶的工业应用）。

4固定化酶的研究进展固定化酶对提高酶的稳定性，拓展酶的应用领域具有非常重要的意义。

目前常用固定化方法普遍存在固定化使用试剂和载体成本高，固定化过程中酶的构象受到影响及底物结合部位和活性中心受载体封闭所引起的酶活损失较大，固定化操作过程繁琐等缺点，限制了固定化酶的产业化应用。

针对当前固定化酶载体和方法的不足，本文采用反相悬浮包埋法合成磁性琼脂糖微球，经环氧氯丙烷和亚氨基二乙酸处理使微球带上螯合基团，经吸附铜离子后，制备了磁性琼脂糖—亚氨基二乙酸(IDA)-Cu2+金属螯合载体，利用该载体定向固定了木瓜蛋白酶，固定化最适条件为Cu2+1.5×10-2mol/g载体、固定化时间4h、固定化pH7.0、给酶量30mg/g载体。

固定化酶的最适反应温度70℃、最适反应pH8.0，固定化酶的热稳定性明显高于溶液酶，固定化酶活力回收为68.4％，且有较好的操作稳定性，载体重复使用5次后固定化酶酶活为首次固定化酶79.71％。

本文研究了利用金属螯合载体固定多酚氧化酶时，固定化酶的性质。

得出固定化酶的最适反应温度为50℃，最适反应pH值7.0，固定化酶的酸碱耐受性明显好于溶液酶，固定化酶反复使用6次，酶活仍保留50％左右，固定化载体可以反复使用5次，仍保持良好的性能。

在使用金属螯合载体固定化酶时，固定化反应条件温和，对酶的高级结构影响小，酶活回收高；固定化酶的热稳定性明显提高；载体的再生、酶的固定化过程操作简单；固定化酶及载体可多次重复利用，固定化酶生产成本低。

因此该技术在工业上具有广泛的应用前景。

高分子微球具有一定的化学和机械稳定性,能抵抗微生物和酸碱的作用,是优良的固定化酶载体材料.针对制备高活性、高稳定性固定化酶对载体材料的性能要求,评述了高分子微球的组成和功能性基团的可设计性、粒径与形态可控性、多孔和大比表面积等结构性质, 概括了载体结构性质对固定化酶催化活性的影响规律,提出了对不同性质的生物酶"量体裁衣",设计制备特效的载体材料是高分子微球固定化酶研究的发展趋势.同时介绍了固定化青霉素酰化酶和固定化脂肪酶在工业催化领域的应用.首先用分相法和填充法制作了两种多孔玻璃微珠FXBL和TCBL，用它们作为载体分别用物理吸附法、共价偶联法和重氮法固定了α-淀粉酶，在对它们的固定效果比较后，选取了共价偶联法进行了较详细的研究；确定了共价偶联a-淀粉酶的最佳固定条件、最佳应用条件和固定化酶的性质；并研究了多孔玻璃微珠制作条件对固定化酶的影响和多孔玻璃微珠对过氧化氢酶及谷氨酸脱羧酶的固定化效果选用丙烯酸(AA)、N'-羟基琥珀酰亚胺(NHM)为单体,以N',N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)为交联剂,以乙醇水溶液为制孔剂条件下进行反相悬浮聚合,得到珠状共聚物载体,该载体是一种新的酶载体形式,在国内外的相关文献中均未见报道.用红外光谱对其结构进行了表征.对载体与有机胺的胺解反应进行了研究,发现共聚物载体分子链上的丙烯酸-N'-羟基琥珀酰亚胺酯基易于在温和条件下与胺基发生胺解反应,从而为该类载体应用于含游离胺基的生物活性物质分子的固定化提供了依据.5固定化酶的应用价值固定化酶的形式多样，可制成机械性能好的颗粒装成酶柱用于连续生产；或在反应器中进行批式搅拌反应；也可制成酶膜、酶管等应用于分析化学；又可制成微胶囊酶，作为治疗酶应用于临床。

现在又有人用酶膜（包括细胞、组织、微生物制成的膜）与电、光、热等敏感的元件组成一种装置称生物传感器，用于测定有机化合物和发酵自动控制中信息的传递及环境保护中有害物质的检测。

最常用的是酶膜与离子选择电极组成的生物传感器，例如脲传感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧电极组成，脲经脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又继续被硝化菌氧化，总耗氧量则通过氧电极反映出电流的变化，用以计算脲的含量。

5.1 定化酶在工业生产中的应用酶的固定化技术诞生以来,不论是早期从动物脏器和植物种子中提取的酶,还是后来发现的种类繁多、功能多样的微生物酶都已经被覆盖在固定化酶的研究领域中。

固定化酶最早是应工业生产的需求而产生的,到目前为止其最大的应用范围还是在工业生产上。

其中,固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一种,它可以用来催化玉米糖浆生产高甜度的高果糖糖浆。

自1972年这项技术产生以来,科学家已经固定了几种芽孢杆菌和链霉菌中提取的葡萄糖异构化酶,并大量应用于工业生产中。

从目前的资料分析,不论是在我国还是在国际上,今后几十年中它还将是应用最广、市场份额最大的固定化酶。

固定化酰化氨基酸水解酶是最早应用的工业化酶,将酰化氨基酸水解酶固定于DEAE-葡聚糖凝胶上用来连续生产L-氨基酸,不仅降低了酶的消耗量,而且减少了产品后处理的费用。

此外还有一些应用较为广泛的固定化酶:固定化淀粉酶用于淀粉的糖化,可作为酒精和酿造发酵中原料的糖化剂;固定化碱性蛋白酶可以高效去除丝织品和棉织品纤维上的多余蛋白,使织物更加柔软光滑;固定化的酸性蛋白酶还可以将废胶卷上的明胶溶解,回收上面的银颗粒;固定化脂肪酶既可以用来分解动植物油脂,使乳脂中的芳香族脂肪酸游离而增加乳品的风味,也可用在工业上分解油脂生产脂肪酸和甘油,还可以与淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等配合作为消化剂,应用于皮革和毛皮的脱脂清洗;固定化纤维素酶作为一种全新的技术在提高纤维素酶的效能上找到了一个很好的突破口,经过固定化处理的纤维素酶,不但其稳定性有极大提高,而且可以重复利用,易于回收,将纤维素酶用载体包埋,可直接将纤维素糖化,然后连续发酵生产酒精。

5.2 酶在生化制药中的应用固定化酶的另一个巨大市场是用来生产工业、医学等领域的一些纯度要求较高的制剂,这其中有最早生产的氨基酸,还有抗生素、核酸、蛋白质抗体、高纯度的蛋白酶等。

科研人员首先于1973年用固定化的青霉素酰化酶生产制造各种半合成的青霉素和头孢霉素,后来,我国的科学家也不断地尝试各种固定化方法,有的直接用戊二醛交联产该酶的大肠杆菌,也有用ABSE-交联琼脂糖与青霉素酰化酶直接偶联,还有的利用三醋酸纤维素包埋和戊二醛交联相结合固定青霉素酰化酶高产菌,这些试验的结果都显示各种固定化方法均可在很大程度上提高酶的稳定性、增加酶的转化率。

后来某制药公司用聚丙烯酰胺凝胶包埋含有高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌,用于工业上利用延胡索酸转化为L-天冬氨酸。

上海生化所用固定化的3′-核糖核酸酶从RNA中生产3′-核苷酸,使酶的利用率提高了10倍;袁中一等将ABSE-纤维素固定的5′-磷酸二酯酶用来生产5′-核苷酸。

固定化谷氨酸脱羧酶可以生产γ-氨基丁酸,制成了CO2电极,可用于测定谷氨酸的含量。