思考题： 五、思考题：
影响电泳的主要因素? 影响电泳的主要因素?
荧光染料EB染色的原理和优点是什么？ EB染色的原理和优点是什么 * 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？ 1、原理： 原理：
EB： EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐 二氨基- 乙基Bromide)。 EB是一种扁平分子 是一种扁平分子， (Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌 入核酸相邻的碱基之间， 在紫外线激发下 ， 发出红橙 入核酸相邻的碱基之间 ， 在紫外线激发下， 色荧光。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。 色荧光。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。 DNA的结合几乎没有碱基序列特异性
实 验 二
DNA琼脂糖凝胶电泳 DNA琼脂糖凝胶电泳
学时： 学时：3
实验目的： 一、实验目的：
1、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的 原理和方法。 原理和方法。 2、学习核酸染色的方法。 学习核酸染色的方法。
二、实验原理: 实验原理
电泳技术： （一）电泳技术： 电泳定义： 1 、 电泳定义 ： 是指带电粒子在电场中向与其自身
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理： （二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介 电泳是用琼脂糖凝胶 泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法， 泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已 成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖英文名 琼脂中提取出来的 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半 英文名 ，是从琼脂中提取出来的， 乳糖和3.6-脱水- 半乳糖相互结合的链状多糖。 相互结合的链状多糖 乳糖和3.6-脱水- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和 琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶， 琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳 都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶 中具有分子筛效应。 中具有分子筛效应。 分子筛效应
电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢， （5）电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反 之越快； 之越快； 离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢， （6）离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反 之越快； 之越快； （7）电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的 电渗现象：电场中， 相对移动； 相对移动； 支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢， （8）支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之 则快。 则快。
3、加样： 加样： 将样品DNA溶液与加样缓冲液以 的体积比混合， 将样品DNA溶液与加样缓冲液以5 ：1的体积比混合，用 DNA溶液与加样缓冲液以5 微量进样器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量15～ 微量进样器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量15～ 15 20 µl （加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝 胶底部） 胶底部）。 4、电泳： 电泳： 为了获得电泳分离DNA 片段的最大分辨率 ， 电场强度不 为了获得电泳分离 DNA片段的最大分辨率 DNA 片段的最大分辨率， 应高于5V/cm（两电极间的距离）开始时用较高电压(80V) V)， 应高于5V/cm（两电极间的距离）开始时用较高电压(80V)， 样品一进入胶内则将电压调至5 样品一进入胶内则将电压调至5V/cm 。当染料前沿移至底边 mm时 电泳毕。 1-2mm时，电泳毕。 5、染色、观察、显微照相与记录： 染色、观察、显微照相与记录： 关 闭 电 源 ， 取 出 胶 床 ， 浸 入 0.5μg/mL 的 EB 溶 液 中 ， 30min后取出。在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA（红橙色荧 30min后取出。在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA（ min后取出 DNA 并进行显微照相。最后要求绘制DNA电泳图谱。 DNA电泳图谱 光），并进行显微照相。最后要求绘制DNA电泳图谱。
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 ）
凝胶中， 片段迁移率与DNA分子大小成反比 20kb) ，因此通 分子大小成反比(≤ 凝胶中，DNA片段迁移率与 片段迁移率与 分子大小成反比 过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可 过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较， 测出未知片段的大小。 测出未知片段的大小。
DNA分子在 高于其等电点的溶液中带负电荷 高于其等电点的溶液中带负电荷， DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场 分子 中向正极移动（电荷效应） 中向正极移动（电荷效应） 。 DNA分子泳动速率的大小除与 分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关 分子泳动速率的大小除与 分子的带电量有关 还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶 分子的大小和空间构象有关（ 外，还与 分子的大小和空间构象有关 的分子筛效应）。 分子筛效应）。 电泳时， 溴酚蓝做前沿指示剂，指示 电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，指示DNA样品在凝 做前沿指示剂 样品在凝 胶中的确切位置。 胶中的确切位置。 溴乙啶是一种荧光染料，可插入 溴乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两 是一种荧光染料 双螺旋结构的两 个碱基对之间， 分子形成络合物， 个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激 分子形成络合物 发下发出橙黄色的荧光。这次实验使用溴乙啶替代品 发下发出橙黄色的荧光。这次实验使用溴乙啶替代品 （DNAgreen） ）
所带电荷相反的电极方向移动的现象。 所带电荷相反的电极方向移动的现象。 根据电泳支持介质的不同， 可分为滤纸 ， 醋酸纤维薄 根据电泳支持介质的不同 ， 可分为滤纸， 淀粉、 琼脂糖、 聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 膜 ， 淀粉 、 琼脂糖 、 聚丙烯酰胺凝胶电泳等 。 电泳技术的 应用非常广泛， 从分离小分子如氨基酸、 激素、 应用非常广泛 ， 从分离小分子如氨基酸 、 肽 、 激素 、 核苷 酸到复杂的大分子如蛋白质、 酸到复杂的大分子如蛋白质 、 核酸甚至病毒颗粒的分离鉴 定都依赖于电泳技术。 定都依赖于电泳技术。
2、影响电泳的主要因素： 影响电泳的主要因素：
带电颗粒的大小和形状：颗粒越大， （1）带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度 越慢，反之越快； 越慢，反之越快； 颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢， （2）颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反 之越快； 之越快； 溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢， （3） 溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之 越快； 越快； 溶液的pH pH值 影响被分离物质的解离度， （4）溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等 电点越近，电泳速度越慢，反之越快； 电点越近，电泳速度越慢，反之越快；
（2）核酸构象与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 ）
不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线 直线DNA>开环的双链 不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链 的移动速度次序为 环状DNA(当琼脂糖浓度太高时，环状DNA不能进入胶中 。 当琼脂糖浓度太高时，环状 不能进入胶中)。 环状 当琼脂糖浓度太高时 不能进入胶中
DNAgreen核酸染料
DNAgreen是一种花箐类染料，具有安全、灵敏作 为各种核酸电泳的染色剂。 DNAgreen最大吸收峰在510nm左右，另外在254380nm还有一个吸收峰，与核酸结合后发射绿色荧 光，因此在紫外凝胶透射仪上可以检测出DNA样品。 作为EB的一种替代品。
（三）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
DNA Marker
荧光染料EB染色 荧光染料 染色 后，在紫外灯 (λ305nm)下观察 下观察 到的电泳结果： 到的电泳结果：
三、实验材料、仪器和试剂： 实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：提取的小麦苗中的DNA 实验材料：提取的小麦苗中的DNA 2、仪器： 仪器： (1)稳压稳流电泳仪 (3)水平电泳槽 (3)水平电泳槽 (2)可调微量移液器 （4）暗箱紫外透射仪等。 暗箱紫外透射仪等。
（3）不同大小的 ）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳 需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳 分离。 分离。
琼脂糖浓度/% 琼脂糖浓度/% 线状DNA大小/kb 线状DNA大小/kb DNA大小
0.3 60-5 0.6 20-1 0.7 10-0.8 0.9 7-0.5 1.2 6-0.4 1.5 3-0.2 2.0 2-0.1
四、实验步骤： 实验步骤：
1、凝胶板的制备： 凝胶板的制备： 取琼脂糖0 TBE缓冲溶液100ml 于沸水浴中至熔化， 缓冲溶液100ml， （1）取琼脂糖0.7 g，加1×TBE缓冲溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制 的琼脂糖胶液。 成0.7%的琼脂糖胶液。 （2）胶床两头贴上防水胶带，形成8mm高的挡墙，压紧胶带，置水平台面 胶床两头贴上防水胶带，形成8mm高的挡墙，压紧胶带， 高的挡墙 上。 （3）插入梳子，梳齿下端离板底0.5－1mm。 插入梳子，梳齿下端离板底0 mm。 （4）当琼脂糖胶液温度降到60℃的时候,将60℃凝胶不间断倒入胶床，高 当琼脂糖胶液温度降到60℃的时候, 60℃凝胶不间断倒入胶床， 60 mm，避免产生气泡，室温下凝固。 3－4mm，避免产生气泡，室温下凝固。 完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液， （5）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶 mm， 梳子，除去产生的气泡。 面1－2mm，从一头轻轻斜拉 梳子，除去产生的气泡。
3、试剂： 试剂： 电泳缓冲液：Tris（1）电泳缓冲液：Tris-硼酸－EDTA（50×TBE）pH8.3。 －EDTA（50×TBE）pH8 25% 40% （ 2 ） 加 样 缓 冲 液 ： 0.25% 溴 酚 蓝 （ BPB ） ， 40% 蔗 糖 ， DNAgreen。 DNAgreen。 (4)琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。 琼脂糖凝胶：浓度为0
DNA片段在 500bp之间时 片段在5 之间时， 注：DNA片段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE）进行电泳分离。 （PAGE）进行电泳分离。