动物蛋白酶解研究（I）北京工商大学宋焕禄天调食品配料有限公司廖国洪摘要本文主要目的是以美拉德（Maillard）反应产物（MRPs）的风味为判断依据，以水解度(DH)为动物蛋白酶解液——Maillard反应底物之一的特征性指标，根据MRPs 的风味确定动物蛋白水解液的最佳DH或DH范围。

实验的主要内容包括：1.以牛肉为酶解底物，对所用的几种蛋白酶进行酶活测定2.确定各酶的适宜加量和反应时间3.确定最佳酶组合及其最佳反应条件4.用最佳反应条件下制得的动物蛋白水解液进行Maillard反应，感官评定产物风味。

关键词动物蛋白水解液水解度（DH）酶解Maillard反应1．概述1.1肉味香精研究进展肉味香精研究及生产中有关肉味形成机理的报道很多。

随着肉味香精的需求量日益增加，有关肉味香精的研究也不断深入和扩展。

肉味香精中各种香味物质的形成主要是通过Maillard反应产生。

参与反应的底物中氨基酸或多肽对风味物质的形成有重要影响。

根据已有的研究结果，通常认为，Maillard反应产物中含硫化合物、杂环化合物和羰基化合物对肉味形成有重要影响[1]。

这些风味物质的形成机理极其复杂。

杂环化合物中以吡咯类、吡嗪类、噻吩类等化合物贡献较大[2]。

对Maillard反应产物的一系列研究表明，它还具有抗氧化、抗诱变等多种性能[3]。

此外，人们还从蛋白质结构及肽键顺序等方面对Maillard反应产物进行分析，以期找到它们与产物风味之间的某种关系[4]。

酶解法是一种新兴的动物蛋白水解液的生产方法。

与已有的生产方法相比，酶解法有很多优点，因此对酶法生产动物蛋白水解液的研究很受重视。

人们从酶解机理、酶解原料、酶及酶解液等多方面进行了大量深入研究。

G.M.O′Meara和P.A.Munro以米氏方程和兰格缪尔等温吸附模型为基础，研究了瘦肉的酶解动力[5]，并对酶解反应的影响因素如pH值、温度、时间、酶/底物比及底物浓度分别进行研究[6]。

研究者还试图从不同途径寻找更有效的酶，研究酶的性质、结构、作用特点、反应条件以及单、多酶水解效果的比较、不同底物水解效果的比较,等等[7]。

人们还注意到，由于水解条件的变化，得到的水解液有时会含有苦味，并影响到后面的Maillard反应产物的风味。

研究认为，其原因是某种蛋白质含有疏水性氨基酸，它们常隐藏在蛋白质内部中，一旦水解暴露出来就会显出苦味[8,9]。

生产动物蛋白水解液的原料由于价格问题，生产成本一直降不下来。

近年来人们一直在寻找价廉易得的生产原料，已用于生产的有植物蛋白替代品、肉类生产副产物（骨头残肉、动物毛血等），但存在很多问题和欠缺，有待解决。

1． 2 蛋白质水解液的生产方法 1.2.1酸/碱法：酸/碱水解法较早用于生产,工艺条件比较成熟。

该法主要是用浓酸或浓碱在加热条件下降解蛋白质,得到的水解液经过中和后即可用于生产。

酸水解法的优点是水解很彻底,目前该产品广泛用做为调味品的原料，缺点是某些氨基酸被破坏，且需控制水解液中的氯丙醇含量[10,11]。

碱法水解不被推荐，因为不仅水解液味道很较，且其中氨基酸会发生消旋化。

1.2.2 酶水解法用蛋白酶在其适宜的作用条件下水解蛋白质,得到的水解液经过灭酶后就可以用于生产。

酶解法的优点是作用条件温和,产物安全无毒,而且基础风味纯净。

但是酶法生产的水解液水解度不高,这会影响到后来的Maillard 反应产物的风味。

酶解法目前应用非常广泛,并且越来越受到重视。

1.2 酶解法1.酶解机理[8]一般认为,蛋白质酶解时肽键水解断裂的过程如下:a.肽键断开-CHR-CO-NH-CHR ′- + H 2OE -CHR-COOH + NH 2-CHR ′-b.质子交换-CHR-COOH + NH 2-CHR ′- -CHR-COO - + NH 3+-CHR ′-c.氨基滴定NH 3+-CHR ′- + OH - NH 2-CHR ′- + H 2O 2.影响因素蛋白质酶解的影响因素包括温度、pH 值、时间、酶量、底物浓度等。

不同的酶对应有不同的最适pH 值、最适温度及反应时间等条件要求。

对同一种酶来说，底物不同则反应条件也不尽相同，由此得到的产物也各不相同。

3.常用的蛋白酶类酶法生产蛋白质水解液常用的几种酶及其特性如下表所示:注：1U ——40℃、pH3.0时1min 内水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸的酶量。

1AU——25℃下1min内水解变性血红蛋白产生1mmol酪氨酸的酶量。

1LAPU——25℃下1min内水解1mmol的L-leu-对硝基苯胺的酶量。

2．实验材料与方法2.1 实验材料2.1.1 原料市售新鲜鸡胸肉，绞碎后冷藏备用。

2.1.2 试剂磷酸盐（标准物质）缓冲液 pH6.864硼砂（标准物质）缓冲液 pH9.182 上海市爱建现成试剂厂邻苯二甲酸氢钾缓冲液 pH4.003氢氧化钠分析纯北京化工厂硫酸铜分析纯新乡市第八化工厂硫酸钾分析纯北京化工厂硼酸分析纯哈尔滨市化工试剂厂盐酸化学纯北京化工厂浓硫酸分析纯北京化工厂1%酚酞乙醇指示剂（1g酚酞溶于100ml乙醇中）无水乙醇化学纯北京化工厂无水碳酸钠分析纯北京化工厂邻苯二甲酸氢钾分析纯北京化工厂磷酸氢二钠分析纯北京红星化工厂磷酸二氢钠分析纯北京红星化工厂三氯乙酸分析纯福林试剂实验室自备（1份试剂与1.5份水混合）干酪素化学纯上海化学试剂供应站L-酪氨酸 BR 公私合营上海生物化学制药厂甲醛优级纯北京市旭东化工厂Flavorzyme Novo Nodisk 公司提供Alcalase Novo Nodisk 公司提供Protamex Novo Nodisk 公司提供Neutrase Novo Nodisk 公司提供中性蛋白酶无锡酶制剂厂植物蛋白水解液自制L-半胱氨酸盐酸盐木糖氯化钠2.1.3 设备电子万用炉 1000W 天津市中环实验电炉有限公司改良式微量凯氏定氮蒸馏装置光学读数分析天平 TG328B 上海第二天平仪器厂架盘药物天平 HC-TP11B• 5 北京医用天平厂上皿电子天平 JA2003 上海天平仪器厂精密酸度计 PHS-2C型上海雷磁仪器厂电热恒温水浴锅 HH-S112型江苏省医疗器械厂磁力加热搅拌器 HJ-1型江苏省国华仪器厂分光光度计 721型上海第三分析仪器厂离心沉淀器 800型上海手术器械厂阿贝折光仪高压灭菌锅山东新华医疗器械厂2.2实验方法2.2.1 样品蛋白质含量的测定：微量凯氏定氮法2.2.2 酶活测定：福林法2.2.3 固形物含量测定：折光法测定。

2.2.4氨态氮测定：甲醛电位滴定法。

2.2.5 水解度（DH）的测定水解度的定义是水解肽键数占肽键总数的百分比。

测定水解度（DH）采用n-NH2式中V-V0氢氧化钠标准溶液滴定耗用量（ml）C 氢氧化钠标准溶液浓度（mol/L）W 水解用样品克数（g）V tot水解液总体积(ml)V 水解液取用体积(ml)h tot=(1×Pro%)/110式中h tot原料蛋白质中所含肽键总数（mmol/g原料）Pro% 样品的蛋白质含量110 氨基酸平均分子量则有DH%=(n-n0)×100/h tot3.研究內容与结果讨论3．1样品蛋白质的测定：经凯氏定氮法测定，样品的蛋白质含量为20.07% 。

3．2 酶活测定3.2酶加量及反应时间的确定3.3.1实验步骤以参考资料为依据，设定几个加酶量水平，通过测定不同反应时间下的水解度，作水解度对加酶量曲线和水解度对时间曲线，可大致确定合适的加酶量及反应时间。

具体作法是：称取50g鸡胸肉，加入50ml蒸馏水，在80℃水浴中加热10min后冷却。

调节pH值至各酶的最佳值处，按所设加酶量称加酶后于水浴中进行酶解，到达设定的反应时间后取5ml水解液，加入25ml蒸馏水，用甲醛滴定法测水解度。

3.3.2 结果讨论1.中性蛋白酶（pH7.5、37℃）图1 DH-酶量曲线（中性蛋白酶）图2 DH―时间曲线（中性蛋白酶）由图1及图2可以看出，中性蛋白酶的加量在200U/g蛋白以后水解液的DH 值上升趋势基本趋于平缓，而反应时间则在3h以后水解液的DH值已趋于平缓。

因此中性蛋白酶的适宜加量和反应时间确定为250U/g蛋白、3h。

2．Neutrase (pH6.5, 55℃)图3 DH—酶量曲线(Neutrase)图4 DH-时间曲线(Neutrase)由图3及图4可见，Neutrase的适宜加量比较小，其加量大于150U/g蛋白以上水解度（DH）变化已经很小；反应时间在3h以后DH变化就不明显了。

可见Neutrase的适宜加量及反应时间可定为150U/g蛋白、3h。

3. Protamex (pH6.5, 55℃)图5 DH—酶量曲线(Protamex)图6 DH—时间曲线(Protamex)由图5和图6，Protamex加量大于1000U/g 蛋白、反应时间大于6h以后曲线的上升趋势已近平缓，因此可以选定1000U/g蛋白、6h为其适宜加量和反应时间。

4. Alcalase (pH7.5, 55℃)图7 DH—酶量曲线(Alcalase)图8 DH—时间曲线(Alcalase)由图7及图8可以确定Alcalase的适宜加量为1500U/g蛋白，8h。

5. Flavorzyme (pH7.0，50℃)图9 DH—酶量曲线(Flavorzyme)图10 DH—时间曲线(Flavorzyme)由图9及图10，Flavorzyme的DH—酶量曲线基本上都在上升，并没有出现一个理论上的适宜值。

从经济角度考虑，取200U/g蛋白的加量。

而其反应时间在8h 以后DH变化已不明显。

3.3最佳酶组合的确定3.4.1实验步骤称取200g鸡胸肉，加入100g蒸馏水，于80℃水浴中加热10min，调节pH 值至酶的最适pH值处，称加酶后于水浴中进行酶解并间隔搅拌。

每隔1h取10ml 水解液，定容至100ml,取10ml进行甲醛滴定测DH值。

1. Alcalase & Flavorzyme(A&F)2. Protamex&Flavorzyme(P&F)3. Neutrase&Flavorzyme(N&F)4. 中性蛋白酶&Flavorzyme(Z&F)3.4.2 结果分析由实验数据得到的四个酶组合A&F、P&F、N&F、Z&F的固形物—时间曲线、Aa-N—时间曲线及DH—时间曲线如下：图11 固形物—时间曲线图12 Aa-N—时间曲线图13 DH—时间曲线由图11、图12和图13可以看出，四种酶的固形物—时间曲线很相似，差别并不大，但是它们的Aa-N—时间曲线、DH—时间曲线差别就很明显：P&F酶组合变化最显著，另外三个酶组合相差不大。