连接介 导的PC R原理示 意图
4. 盒式PCR
方法
第一节 PCR扩增法获得目的基因
在普通PCR过程中加入了一个 Cassette（盒）
人工合成的带有限制 性内切酶的粘性末端 的双链DNA分子
第一节 PCR扩增法获得目的基因
特点
Cassette在设计时其5′末端没有磷酸基团
目的DNA片段的3′末端和Cassette的5′末端的 连接部位形成缺口
3’端之间的未知序列 3’RACE 5’端之间的未知序列 5’RACE
第一节 PCR扩增法获得目的基因
锚定PCR被用于RACE技术，根据锚定序列引入 方式的不同，RACE分为经典RACE和新RACE 经典RACE ：以锚定序列作为引物，3’RACE 中在反转录时引入第一链cDNA，5’RACE中在 合成第二链时引入第二链cDNA 新RACE ：锚定序列在反转录以前以寡聚核 苷酸RNA的形式连入mRNA中
1. 反向PCR
扩增对象
第一节 PCR扩增法获得目的基因
用于扩增已知目的基因序列侧翼的DNA片段
操作过程
酶切
连接环化 PCR扩增 测序分析
第一节 PCR扩增法获得目的基因
RS:限制性内切酶酶切位点 GSP:基因特异引物
反向PCR原 理示意图
2. 锚定PCR 锚定PCR 1.
扩增对象
第一节 PCR扩增法获得目的基因
第六章 目的基因克隆
第一节 PCR扩增法获得目的基因
第一节 PCR扩增法获得目的基因
本节要点
RT-PCR法 RT-PCR的步骤 三种不同引物引导的RT-PCR 已知基因N端部分序列RT-PCR 其它PCR法 反向PCR 锚定PCR 连接介导的PCR 盒式PCR RACE
只知道DNA一端的序列又要对未知的一端进行测序
对体内甲基化图谱或DNA印迹进行分析
方法
在普通PCR过程中增加了连接的步骤，即通过连 接反应加上去一个公共接头
第一节 PCR扩增法获得目的基因
引物
引物1 引物2
通过目的基因的已知序列设 计的基因特异引物 接头引物
第一节 PCR扩增法获得目的基因
第一节 PCR扩增法获得目的基因
mRNA
采用亲和层析法
oligo(dT)纤维素 柱分离纯化真核 mRNA
反转录
将RNA反转录成cDNA第一链
第一节 PCR扩增法获得目的基因
反转录的引物 ：三种
三种引物扩增特异性
基因特异引物（gene specific primer，GSP）
高
多聚寡核苷酸引物（oligo (dT) primer）
在第一次PCR的第一个循环，从Cassette引物 CP1开始的延伸反应在连接部位终止，限制了 引物 CP1和引物 CP1同一引物之间的扩增，减 少了非特异性PCR扩增
第一节 PCR扩增法获得目的基因
CP:Cassette引物 GSP:基因特异引物 （正义引物） AGSP:基因特异引物 （反义引物）
也称之为单侧特异引物PCR（SSP-PCR）， 是根据已知目的基因的一小段序列信息来快速 扩增已知序列上游或下游片段的技术
引物
引物1 根据已知序列设计的基因特异引物 引物2 即锚定引物，根据序列的共同特征设计的非特 异性引物，非特异性引物所起的作用是在其中 一端附着。与锚定引物结合的序列称为锚定序 列。
盒式P CR原 理示 意图
第一节 PCR扩增法获得目的基因
5. RACE
rapid-amplification of cDNA ends
通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增， 得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完 整序列的方法
过程和分类
以mRNA为模板反转录成cDNA第一链 用PCR扩增出 cDNA内某一已知 序列位点到其
第一节 PCR扩增法获得目的基因
方法
扩增目的基因已知序 列下游3’端未知序列
oligo（dT）作为锚定 引物 用DNA末端转移酶， 在cDNA 3’ 末端加上 Poly（dA）尾 与此Poly（dA）相 对应的Poly（dT）作 为锚定引物
扩增目的基因已知序 列上游5’端未知序列
第一节 PCR扩增法获得目的基因
根据密码子的简并性 设计的针对编码每个 氨基酸的所有碱基组 合的混合物
简并引物
第一节 PCR扩增法获得目的基因
已知基 因N端 部分序 列RT-P CR示意 图
第一节 PCR扩增法获得目的基因
二、其他PCR法
适用对象
获得的目的基因的DNA片段不完整，仅知 道基因上一小段序列信息时
方法
反向PCR 锚定PCR 连接介导的PCR 盒式PCR RACE
第一节 PCR扩增法获得目的基因
一、RT-PCR法
1.RT-PCR的步骤
获得RNA模板
反转录
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱPCR扩增
反转录 ：将RNA反转录 成cDNA第一链
第一节 PCR扩增法获得目的基因
常用RNA模板
细胞总RNA
常采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一 步抽提法 提取的总RNA中只有少部分是 mRNA，大部分为rRNA和 tRNA TRIzol是一种新型总RNA抽 提试剂，含有苯酚、异硫氰 酸胍等物质.
第一节 PCR扩增法获得目的基因
2. 三种不同引物引导的RT-PCR
RNA 提取
反 转 录
第一节 PCR扩增法获得目的基因
PCR 过程
第一节 PCR扩增法获得目的基因
3. 已知基因N端部分序列RT-PCR
扩增对象
目的基因的DNA序列未知，但其编码蛋白的N端部 分氨基酸序列已知
扩增方法
根据氨基酸序列设计的简并引物和oligo（dT）进 行RT-PCR
PCR具体过程
包括两轮PCR扩增
第一轮：采用不对称PCR 高浓度的基因特异引物和低浓度的非特 异性引物
第二轮：以稀释后的第一轮PCR产物作 为模板 相同浓度的基因特异引物和非特异性引 物进行扩增
第一节 PCR扩增法获得目的基因
锚定PCR原理示意图
3.连接介导的PCR
应用范围
第一节 PCR扩增法获得目的基因
随机六核苷酸引物（random hexamer primer）
低
第一节 PCR扩增法获得目的基因
PCR扩增
以合成的cDNA单链为模板，采用基因特异引物 进行常规PCR扩增
过程： 上游引物与cDNA第一链退火，在DNA聚 合酶的作用下合成cDNA第二链 以cDNA第一链和第二链为模板， 用上、下游引物进行PCR扩增