高效液相色谱法(HPLC) 测定牛乳中α-乳白蛋白Determination of α-lactalbumin in milk products by high performance liquid chromatography ( HPLC)关荣发1，黄光荣1，贾振宝1，戴贤君1，叶兴乾2 GUAN Rong-fa1, HUANG Guang-rongn1, JIA Zhen-bao1, DAI Xian-jun1, YE Xing-qian2（1.中国计量学院生命科学学院，杭州310018; 2.浙江大学食品科学与营养系，杭州310029）(1. College of Life Sciences, China Jiliang University，Hang Zhou 310018; 2. Department ofFood Science and Nutrition, Zhejiang University, Hangzhou 310029) 摘要: 建立了利用常规的C18色谱柱的高效液相色谱测定牛乳中主要过敏蛋白α-乳白蛋白含量的方法。
色谱条件: 色谱柱Alltima-C18( 4.6 mm×200 mm, 5μm) , 柱温为45℃, UV 检测波长2l5 nm, 流动相A为含0.1%三氟乙酸的超纯水,流动相B为乙腈∶超纯水∶三氟乙酸=400∶100∶0.5，采用梯度洗脱方法，流速0.8mL/min。
结果表明: α-乳白蛋白的线性范围分别为50μg/mL-1000μg/mL( r=0.9909); α-乳白蛋白平均回收率为97.27 %, RSD=0.76%(n=5);该方法简便、准确, 适合于乳制品中α-乳白蛋白含量的测定。
关键词: 高效液相色谱法; α-乳白蛋白; 乳制品; 测定Abstract: A method for the determination ofα-lactalbumin in milk products by high performance liquid chromatography has been established. The chromatography conditions as follow: Alltima-C18 conlum (4.6 mm×200 mm, 5 μm), UV detection wavelengts 215 nm. This method consisted of a linear gradient of the two mobile phases of 0.1% trifluoroacetic acid in water and 0.5% trifluoroacetic acid and 80% acetonitrile in water at a flow rate of 0.5 mL/min, The conlum temperature was 25℃.The result showed that for α-lactalbumin the calibration curve was linear in the range of 50μg/mL ~1000μg/mL( r=0.9909). The average recovery percent was 97.27, the RSD was0.76%( n=5).The methods is suitable for contents analysis of α-lactalbumin in milk products.Key words: high performance liquid chromatography; α-lactalbumin; milk products; determination 随着人们生活水平的提高，奶制品在国内的消费量迅速增加，2005年我国城镇居民奶类人均消费量（折鲜奶）已达25公斤以上，饮用UHT奶、巴氏杀菌奶等液态奶已在我国渐成习惯，液态乳已经成为我国的主要乳制品。
但牛乳过敏是儿童中一种常见的食物过敏，严重地影基金项目：浙江省分析测试科技计划项目（编号：2007F70027）作者简介:王关荣发(1975 - )男,中国计量学院生物安全与食品科学研究所讲师,博士研究生。
E-mail:rfguan@163. com响儿童的身体健康[]1。
在成年人中牛乳过敏也时有发生，已引起了全球的广泛关注[]2。
牛乳中的主要过敏成分有α-乳白蛋白、酪蛋白和β-乳球蛋白等。
2002年国际食品规范委员会提议对欧洲的食品标签法规进行修改，提议对所有的食物中的过敏成分进行标识[]3。
这一提议对保护食物过敏人群非常有利，但同时也要求更可靠有效的食物过敏原检测方法来确保它的实施。
用于检测牛乳过敏原的方法主要有：免疫吸附实验、SDS-PAGE电泳、酶联免疫吸附实验、聚丙烯凝胶电泳结合激光扫描、电泳和毛细管电泳等方法。
但以上各种方法在测定α-乳白蛋白时都有一定的难度，难以在实践中应用。
反相高效液相色谱法是分析乳清蛋白成分的有效方法之一，与其他色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势,国内外相关的α-乳白蛋白液相测定方法需要专门的C4色谱柱，而C4色谱柱用途不及C18色谱柱广泛。
本文采用C18色谱柱，优化了α-乳白蛋白的分析条件，与现有的方法相比,可以利用常规的C18色谱柱，缩短了分析时间，建立的定量测定α-乳白蛋白的方法为监测目前市场中各类乳制品中的α-乳白蛋白及低过敏乳制品的研究和质量提供了有效的方法。
1 材料与方法1.1 试验材料生乳：浙江省杭州二牧奶牛场，浙江省杭州普利奶牛场，浙江省杭州乔司奶牛场α-乳白蛋白标准品(Sigma公司)乙腈：色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司甲醇：色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司三氟乙酸（TFA）：色谱纯，美国TEDIA公司氯化钠：分析纯, 上海光铧科技有限公司叠氮化钠（Sodium Azide），分析纯, 浙江东阳利得医药化学有限公司1.2 仪器BioSafe Avanti J-10 型高速冷冻离心机：美国贝克曼有限公司C5型超高压均质机：加拿大A VESTIN公司Delta 320-S pH计：瑞士梅特勒公司Millex-HA 型滤器：美国密理博公司Hitachi(日立) CR22G高速冷冻离心机：日本日立公司Waters2695 型高效液相色谱仪：美国Waters公司Warters 2996二级管阵列检测器：美国Waters公司QL-901型旋涡混合器：东莞市华达电子仪器有限公司Waters Oasis HLB Extracton Cratridge：美国Waters公司Alltima-C18色谱柱(4.6mm x 250mm, 5μm，美国奥泰科技(中国)有限公司)1.2 试验方法1.2.1 色谱条件流动相：流动相(A)：超纯水含0.1%三氟乙酸（TFA），流动相(B)：乙腈+超纯水+三氟乙酸(400/100/0.5)，流速0.8mL/min，柱温45℃，检测波长：215nm表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition时间Time（min）流速mL/min洗脱液ASolvent A (%)洗脱液BSolvent B (%)0 0.8 64 3620 0.8 44 5630 0.8 40 6035 0.8 64 3638 0.8 64 361.2.2 对照品溶液的制备精确称取α-乳白蛋白标准品16mg，用超纯水配制成1.6mg/mL的原液；适量吸取原液，配制成标样浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL的系列标准液。
1.2.3 样品供试液的制备将牛乳于20℃条件下，以2000g离心20min后，把上层脂肪去掉；取上清液于10mL离心管中，置于-20℃保存，待测；分别取5mL0.10mol/L,pH 4.6醋酸缓冲液和1mL上清液于10mL离心管中；用漩涡振荡器混匀牛乳样品后，于室温下以4000g离心10min；取上清液，用0.45μm水性滤器过滤到1.5mL离心管中，滤液用于α-乳白蛋白的测定。
2 结果与分析2.1 流动相的选择采用反相高效液相色谱方法分析蛋白的流动相系统基本为三氟乙酸的水溶液和乙腈溶液，采用梯度洗脱，但随着样品的不同及色谱柱的不同，梯度洗脱条件也随之改变。
在蛋白质的反相液相色谱分离中，初始洗脱条件下流动相中有机溶剂的浓度较低，蛋白质与固定相间的疏水作用较强，蛋白质几乎完全被固定相吸附。
而一旦流动相中的有机溶剂达到特定的浓度，使蛋白质与固定相的作用小于与流动相的作用时，蛋白质就会完全从固定相上洗脱下来，几乎不再与固定相发生作用。
本试验尝试了以不同比例的三氟乙酸的水溶液和乙腈溶液作流动相。
当以高比例的水进行梯度洗脱时，蛋白质的出峰时间延迟；而以高比例的乙腈进行梯度洗脱时，多肽及蛋白质的出峰时间缩短，但α-乳白蛋白和β-乳球蛋白不能分开。
在兼顾保留时间和分离度的前提下，最终选择用于测定α-乳白蛋白的流动相及梯度洗脱条件如“1.2.1”节所述。
标准品和样品的分离结果分别见图1和图2。
a:α-乳白蛋白图1 标准品HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of standard reference2.2 回归方程、线性范围及检出限精确称取α-乳白蛋白标准品6mg，用超纯水配制成0.6mg/mL的原液；适量吸取原液，配制成标样浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6mg/mL的系列标准液，按1.2.1所述色谱条件进行测定, 以峰面积为纵坐标, 浓度为横坐标做标准曲线, 得α-乳白蛋白的回归方程为Y=1406800X+1221.4(r=0.9909)，线性范围为50μg/mL-1000μg/mL; 以信噪比S/N=3 计算α-乳白蛋白的检测限为30ng色谱图（见图1）。
2.3 加样回收率实验以同一奶粉配制的牛奶为空白样品，精确定量加入α-乳白蛋白标准品溶液，按样品处理方法制备样品液，进行测定，用已知浓度的样品溶液定溶, 按1.2.1 所述色谱条件, 每样平行测定5 次, 每次进样50μL, 测定其中α-乳白蛋白的含量, 计算回收率, 得α-乳白蛋白平均回收率为97.27%，RSD=0.76%( 结果见表1)。
表1 α-乳白蛋白回收率(n=5) Table 1 Recovery ofα-lactalbumin (n=5)本底含量（mg/mL）Background amount/（mg/mL）加入量（mg/mL）Added amount/（mg/mL）测出量（mg/mL）Detectable amount/（mg/mL）平均回收率/%Averagerecovery/%RSD/%0.601 0.05 0.649 96.4 3.840.601 0.1 0.699 97.6 3.570.601 0.2 0.797 97.8 2.362.4 精密度实验取同一对照品溶液(α-乳白蛋白0.2 mg/mL) , 按1.2.1 所述色谱条件进行测定, 连续进样5次, 每次50μL记录色谱峰面积, 计算相对标准偏差, 结果α-乳白蛋白RSD=0.86 %。