关于硫氢化钠后处理对培养心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用【关键词】硫化氢后处理心肌细胞培养缺氧复氧损伤大鼠Abstract： Objective To explore the protective effects of H2S donor-NaSH postconditioning on the primary-cultured neonatal rat myocardial cells exposed to hypoxia/reoxygenation （H/R） injury. Methods Primary- cultured myocardial cells from neonatal rats were randomly pided into 4 groups: control group（normal）， hypoxia/reoxygenation group（H/R），hypoxia postconditioning group（HPC） and NaHS postconditioning group（H/R+NaHS）. A model of H/R injury was reproduced by exposing the cell culture to 2 h of hypoxia and 2 h of reoxygenation. The percentage of surval cells， the activities of lactate dehdrogenase (LDH) and superoxide dismutase (SOD)， and the content of malondialdehyde (MDA) were determined at the points of pre-hypoxia， hypoxia for 2 h and reoxygenation for 0.5 h ，1 h and 2 h. Results No obvious changes were detected in H/R group， HPC group and H/R+ NaHS group until hypoxia 2 h. After standard hypoxia postconditioning and NaHS postconditioning respectively， the surval rate was higher in the HPC and H/R+ NaHS groups than in the H/R group ［(70.5±2.2）% and （66.2±2.5）% vs （61.3±1.8）%， P�0.05］. Meanwhile the activities of LDH in HPC and H/R+ NaHS groups were obviously lower than that in H/R group ［(36.2±1.3）U·L-1 and （39.5±1.5） U・L-1 vs （44.6±1.7） U・L-1，P�0.05］. The contents of MDA in HPC and H/R+ NaHS groups were obviously lower than in H/R group ［(0.905±0.033） mmol・g-1 and（0.986±0.042） mmol・g-1 vs （1.120±0.045） mmol・g-1， P�0.05］; but the SOD activity was significantly higher in HPC group and H/R+ NaHS group than in H/R group ［(16.9±1.0） U・L-1 and （159±1.2） U・L-1 vs （13.3±1.5） U・L-1， P�0.05］. During the whole 2 hours of reoxygenation， the survival rate of cells and the SOD activity in HPC and H/R+ NaHS groups remained higher than in the H/R group， and the activity of LDH and the content of MDA kept to be lower than in H/R group (P�0.05). Conclusion NaHS postconditioning offers protective effect on myocardial cells against hypoxia/reoxygenation injury by enhancing the scavenging of oxygen - derived free radicals.Key words： H2S; postconditioning; myocardial cell culture;hypoxia/reoxygenation injury; rat缺血后处理(ischemic postconditioning)［1］是可以有效对抗缺血/再灌注损伤的一种重要内源性保护机制，长时间缺血后再灌注前，短时间内反复短暂的再缺血处理，可以明显减轻缺血组织的缺血/再灌注损伤。

药物后处理是用药物模拟缺血后处理的方式，试图达到与缺血后处理相似的保护效果。

内源性硫化氢（H2S）作为新发现的气体信号分子，其心肌保护作用近年来受到高度的关注。

研究发现，缺血前给予外源性硫化氢钠（NaHS）可改善因缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury， IRI）引起的心肌功能障碍和心肌损伤［2］。

但NaHS后处理的心肌保护作用尚未见报道。

本研究采用原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞，建立缺氧/复氧损伤模型，探讨NaHS后处理对培养心肌细胞IRI的保护作用及其可能的机制。

1 材料和方法1.1 实验材料胎牛血清（杭州四季青有限公司）；DMEM培养基（GIBCO，America）；胶原酶I、胰蛋白酶（Sigma）；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase， LDH)、超氧化物歧化酶(super oxidedismutase， SOD)、丙二醛(malondialdehyde， MDA)试剂盒，考马斯亮蓝法蛋白测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所出品；其余试剂均为国产分析纯产品。

二氧化碳培养箱（上海），N750紫外分光光度计（上海）。

1.2 实验方法1.2.1 乳鼠心肌细胞原代培养选出生1～3天内的Sprague Dawley大鼠（由徐州医学院实验动物中心提供），雌雄不限。

参照文献［3］方法分离、纯化心肌细胞，制成浓度为1×109・L-1 的细胞悬液，接种于24孔培养板。

取原代培养72 h的心肌细胞进行实验。

1.2.2 实验分组将同批培养的心肌细胞随机分为4组。

①对照组（Normal 组）：将心肌细胞放入37℃含95%空气、5% CO2的二氧化碳培养箱中，用复氧液〔mmol・L-1， 0.9 Na2HPO4，20.0 NaHCO3， 1.8 CaCl2，1.2 MgSO4， 55.0 葡萄糖， 20.0 HEPES(hydroxyerhyl piperazine erhanesulfonic acid，羟乙基哌嗪乙磺酸)，129.5 NaCl和5.0 KCl，pH 7.4〕培养4 h。

②缺氧/复氧组（H/R组）:参照文献［3］，将心肌细胞换用高纯氮气饱和30 min、氧分压低于7 kPa的模拟缺氧液(mmol・ L-1，0.9 Na2HPO4、6.0 NaHCO3、1.8 CaCl2、1.2 MgSO4、40乳酸钠、20 HEPES、98.5 NaCl和10.0 KCl、pH 6.8)，并置于37℃含95% N2、5% CO2的密闭容器中缺氧2 h，然后换为复氧液在二氧化碳培养箱中复氧2 h。

③缺氧后处理组（HPC组）：缺氧2 h后，参照文献［4］方法给予缺氧后处理。

先用复氧液培养5 min，然后换为缺氧液培养5 min，复氧液5 min/缺氧液5 min重复3次，共计30 min，再继续用复氧液培养1.5 h。

④硫氢化钠后处理组（H/R+NaHS 组）：后处理方式同HPC组，用含NaHS复氧液（用复氧液配制，NaHS终浓度为1×10- 6 mo l・L-1，此浓度为预实验所选定）代替缺氧液给予后处理。

1.2.3 观察指标及检测方法每组重复6次，在5个时间点（缺氧前、缺氧2 h和复氧后 0.5 h、1 h、2 h）进行指标测定。

1.2.3.1 台盼蓝排斥试验制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2×10-6・L-1。

然后将心肌细胞悬液0.1 ml和4 g・L-1台盼蓝溶液0.1 ml混匀，用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞数。

按公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.2.3.2 LDH活性收集各个实验组培养基，按照LDH测定试剂盒说明书测定。

1.2.3.3 测定细胞内MDA和SOD 在各个需检测的时间点，吸去培养液，经超声破碎细胞后离心取上清液，按MDA和SOD测定试剂盒说明书进行测定。

1.3 统计学处理计量资料以±s表示。

多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用 Student Newman Kenlsa法进行q检验。

检验水准：α=0.05。

2 结果2.1 培养心肌细胞的一般特性采用上述分离纯化方法培养的心肌细胞刚接种时细胞呈球形悬浮在培养液中；培养 4～6 h后开始贴壁生长，逐渐展开，伸出伪足，由圆形变为梭形、三角形或星形；12～24 h细胞基本贴壁，少数单个细胞呈现不同频率的自发性搏动(40～80次/min)；72 h后细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列，同步节律性搏动(90～120次/min)，收缩明显而有力，形成功能性合体细胞。

2.2 心肌细胞存活率缺氧前各组细胞存活率无显著差异（P�0.05）。

H/R组在缺氧/复氧过程中细胞存活率持续下降，较Normal组显著降低（P�0.01）。

缺氧2 h时，H/R组、HPC组和H/R+NaHS组细胞存活率无显著差异（P�0.05）。