研究论文腺苷对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用王兴祥1,3,周利龙1,丁家望2,冯义柏1,程龙献11华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,武汉430022;2宜昌市中心人民医院,宜昌443000摘要:本研究旨在探讨腺苷(adenosine,ADO对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R心肌细胞的保护作用及其分子机制。
将原代培养的新生大鼠心肌细胞分成H/R对照组和ADO(110μmol/L保护组。
用倒置相差显微镜观察心肌细胞的生长状态。
检测两组培养基质乳酸脱氢酶(LDH活性和心肌细胞Ca2+和丙二醛(MDA浓度。
用EL ISA法检测肿瘤坏死因子(TNF2α的表达,并用凝胶电泳迁移率改变法(EMSA测定核因子(NF2κB结合活性。
所得结果如下:(1心肌细胞H/R培养后皱缩、变圆,伪足减少,ADO组心肌细胞的形态变化小于对照组;(2 ADO减少缺氧和复氧期间心肌细胞LDH的漏出(bothP<0101;(3ADO降低缺氧和复氧期间心肌细胞内的Ca2+浓度(both P<0101;(4ADO降低缺氧和复氧期间心肌细胞MDA浓度(both P<0101;(5ADO抑制缺氧和复氧期间TNF2α的表达(both P<0101;(6ADO抑制缺氧和复氧期间心肌细胞NF2κB结合活性(both P<0101。
以上结果提示:(1外源性ADO可减轻心肌细胞的H/R损伤;(2外源性ADO抑制H/R期间心肌细胞TNF2α的表达;(3外源性ADO可能通过抑制心肌细胞NF2κB结合活性下调TNF2α的表达。
关键词:腺苷;缺氧/复氧损伤;心肌细胞中图分类号:Q463;R540Adenosine protects cardiomyocytes from hypoxia/reoxygenation injuryWAN G Xing2Xiang1,3,ZHOU Li2Long1,DIN G Jia2Wang2,FEN G Yi2Bai1,CHEN G Long2Xian1 1Depart ment of Cardiology,U nion Hospital A f f iliated to Tongji Medical College,Huaz hong U niver2 sity ofScience and Technology,W uhan430022;2Yichang People Hospital,Yichang443000Abstract:The aim of this study was to investigate the protective effect of adenosine(ADOon car2 diomyocytes following hypoxia/reoxygenation(H/Rand its molecular mechanism.Primary cultured cardiomyocytes of neonatal rats were dividedin to two groups,namely H/R(controland ADO(110μmol/Lgroups.The morphologic changes in cardiomyocytes were observed under an inverted phase2 contrast microscope.The following parameters of the two groups were determined:lactate dehydroge2 nase(LDHactivity,intracellular calcium concentration and malondialdehyde(MDAcontent.Tumor necrotic factor(TN F2αassay was performed using an EL ISA kit and N F2κB in the nucleus was analyzed by electrophoretic mobility shift assay(EMSA.The results are as follows:(1after H/R injury,car2 diomyocytes contracted,tending to get round in shape and its pseudopods decreased,while marked mor2 phological changes were not observed in ADO group;(2LDH leakage maintained at a lower level in ADO group than that in the control group during H/R(bothP<0101;(3ADO significantly reduced the concentration of calcium in cells and prevented calcium overload during H/R(both P<0101;(4 ADO markedly reduced the content of MDA during H/R(both P<0101;(5ADO inhibited the pro2 duction of TN F2αduringH/R(both P<0101;and(6ADO down2regulated N F2κB binding activity of cardiomyocytes during H/R(both P<0101。
The results suggest that(1exogenous ADO attenuatesReceived2002205207Accepted20022082263Corresponding author.Present address:Cardiovascular Disease Department,First Affiliated Hospital,Medical School of Zhejiang University,Hangzhou310003,China.Tel:+86257528061397;E2mail:wangxx19730312@yahoo1com1 cnH/R injury of cultured cardiomyocytes;(2exogenous ADO inhibits the production of TN F2αafter H/R injury;(3exogenous ADO prevents the activation of N F2κB,which may be the molecular mechanism of down2regulation of TN F2αexpression.K ey w ords:adenosine;hypoxia/reoxygenation injury;cardiomyocytes腺苷(adenosine,ADO作为心肌细胞的能量代谢产物,在缺血预处理的心脏保护中具有重要作用。
近来研究发现,ADO可下调人和大鼠缺血心肌组织肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor2α,TN F2α的表达,而TN F2α是中性粒细胞介导缺血/再灌注损伤的主要细胞因子[1]。
目前对ADO下调TN F2α表达的分子机制尚不清楚。
有作者报道,心肌组织缺血/再灌注时,核因子κB(nuclear factorκB, N F2κB活性持续增高[2~4],且最近有研究表明ADO可抑制离体心脏缺血/再灌注时的N F2κB活性[5]。
而后者参与了一系列炎症因子的表达调控,包括TN F2α。
本文通过观察外源性ADO对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R心肌细胞的形态结构、损伤指标、TN F2α表达及N F2κB活性的影响,进一步从细胞水平明确ADO的心脏保护作用及其机制,并初步探讨心肌细胞缺氧/复氧损伤时TN F2α与N F2κB活性的关系,为其临床应用提供理论依据。
1材料和方法111主要试剂和仪器胎牛血清和DM EM合成培养基购自G ibco公司。
胰蛋白酶(trypsin购自Difco公司。
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH试剂盒购自上海申能生物技术有限公司。
丙二醛(malondialdehyde,MDA和TN F2αEL ISA试剂盒购自北京邦定泰克生物技术有限公司。
N F2κB寡核苷酸序列、T4多核苷酸激酶、T4激酶缓冲液均购自Promega公司。
[γ232P]A TP购自北京福瑞公司。
ADO 购自Sigma公司。
其余试剂为国产分析纯级。
二氧化碳培养箱购自德国Heraeus公司;倒置相差显微镜购自日本Olympus公司。
112新生大鼠心肌细胞的原代培养取新生1~4 d SD大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物学部提供的心室肌组织并剪碎,用011%胰蛋白酶分次消化,分离心肌细胞。
用含10%胎牛血清、100U/ ml青霉素、100μg/ml链霉素的DM EM培养基制备细胞悬液,以差速贴壁法纯化心肌细胞,使纯度达到90%以上。
以115×106/ml 接种于预先用50 mg/L多聚赖氨酸涂布过的培养瓶中,瓶中置盖玻片供细胞贴附生长,在37℃、95%O2+5%CO2的二氧化碳孵箱内进行培养。
每2d更换一次培养基,取培养4d的单层细胞进行实验。
113H/R损伤模型的建立将心肌细胞用缺氧缺糖培养基培养后,培养瓶内立即充入215%O2+ 9215%N2+5%CO2(1L/min持续90s,以驱除瓶内氧气,37℃密闭培养2h。
将缺氧的心肌细胞换用饱含95%O2+5%CO2的含糖培养基,在正常培养条件下培养1h,建立缺氧/复氧损伤模型。
114实验分组将培养的单层心肌细胞分为2组: (1对照组:按照上述方法,制备缺氧/复氧损伤模型;(2ADO处理组:在培养基中加入ADO(110μmol/L后,立即按对照组程序处理。
各组均缺氧培养2h后再给氧1h。
收集缺氧前、缺氧后2h、再给氧1h后的培养基和心肌细胞用于后续实验指标测定。
各组均在上述心肌细胞培养条件下培养3批细胞并做6份重复测试。
115心肌细胞的鉴定心肌细胞的鉴定采用免疫组织化学方法。
116心肌细胞生长状态的检测心肌细胞复氧1 h后,利用倒置相差显微镜观察心肌细胞的形态学改变,用台盼蓝排斥试验检测心肌细胞的存活率。