多序列对位排列结果
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第五讲
蛋白质性质和结构分析
蛋白质性质和结构分析
序列相似的蛋白质具有相似的三维结构
不同蛋白质中相同的结构域（domain）具有相 似的功能
分析蛋白质的功能
一级结构：氨基酸的排列顺序
关于引物的自动搜索和评价分析
• 推荐使用自动搜索软件：
Primer Premier 5.0
• 推荐使用引物评价软件：
Oligo 5/6
OLIGO 5.0 PCR 引物设计
第四讲
多序列对位排列分析
主要应用于分析基因或蛋白质的进化 通过分析多个基因或蛋白质序列之间的同源性 确定它们在进化上的关系 分析基因家族中新成员的翻译起始位点和内含 子（预测的氨基酸序列的对位排列分析）
引物设计要点
• 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成 的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率 一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证 不出非目的产物的假带。 • 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过 4.5，否则容易 产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致 PCR正常 反应不能进行。 • 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶 识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限 制酶的识别序列，以有利于以后的工作。
2. 分析蛋白质的重复序列 在“Primary structure analysis”栏目选择“REP”分 析软件 在REP主页粘贴序列，点击 “Search for repeats”
• 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，当然由 于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高， 可根据具体情况灵活运用。
引物设计要点
• ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重 要的引物评价指标，一般情况下，在 Oligo 5.0软件的 ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’ 端和中间部分 ΔG值较高，而3 ’端ΔG值相对较低，且 不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有 利于正确引发反应而可防止错误引发。分析其原理， 引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物 与模板序列的整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高， 而3’端 ΔG值影响 DNA聚合酶对模板 DNA 的解链，过 高则不利于这一步骤。
二级结构：主要由氢键维系的结构（α-helix、 β-sheet等）
三级结构：二级结构进一步折叠形成的结构域 许多生物信息学网站具有分析蛋白质性质和结 构的软件:/bio.html 2008-3-17
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（一） 分析蛋白质的一级结构 一级结构：蛋白质的氨基酸序列
PCR 引物设计
引物设计的原则
首先引物要跟模板紧密结合； 其次引物与引物之间不能有稳定的二聚 体或发夹结构存在；
最后引物不能在别的非目的位点引起高
效DNA聚合反应(即错配)。
引物设计需要考虑的因素
围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑 诸多因素，如： • 引物长度（primer length）， • 产物长度（product length）， • 序列Tm值 (melting temperature)， • ΔG值(internal stability)， • 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）， • 错误引发位点（false priming site）， • 引物及产物GC含量（composition），有 时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点， 引进突变等。
对要分析的序列的输入格式有要求，FASTA （Pearson）格式 >sequence 1 ATTGCAGTTCGCA …… >sequence 2 ATAGCACATCGCA… …
分析方法（举例） 在Swiss Institute Bioinformatics（SIB）的EXPSY 分析主页（http://www.expasy.ch）的“Tools and software package” 栏目中点击“Alignment” 在“Alignment” 网页的Sequence alignment－ Multiple－CLUSTALW栏目中选择“My Hits”网 站 在ClustalW网页粘贴序列，点击“align”
引物设计要点
• 一般引物的长度为 16-23bp，常用的长度为 18-21bp， 过长或过短都不合适。 • 引物 3’端的碱基一般不用 A，因为 A 在错误引发位点 的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发 效率相对小一些。 • 引物的 GC 含量一般为 45-55%，过高或过低都不利于 引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
分析基因或蛋白质的功能
2008-3-17
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1. 多序列对位排列分析 （multiple sequence alignment)
两条以上序列的对位排列分析 反转录转座子的反转录酶序列片段
核苷酸序列或氨基酸序列 可以发现保守的结构域（重要功能位点？）最好的进行 Multiple sequence alignment 的方法之一 Internet 上的许多网站具有ClustalW分析软件 可以下载
分析内容
蛋白质的氨基酸组成
等电点（pI）
分子量（molecular weight, Mw） 疏水性（hydrophobicity） 其它
1. 分析蛋白质的pI、Mw、氨基酸组成 ExPASy 主页选择 Primary structure analysis 在“Primary structure analysis”栏目选择 “ProtParam”分析软件 在ProtParam主页粘贴序列进行分析 蛋白质的 pI、Mw、氨基酸组成、消光系数、 半衰期、稳定系数等