• 对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上 相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目 的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的 影响。
反胶团萃取法
• 利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表 面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚 集体。
• 优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。
蛋白质的分离纯化——分子量
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子量大 小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子 物质分开,并且不同分子量的蛋白质也得到分离。
常 • 透析 用 • 超滤 方 • 离心 法 • 凝胶过滤
蛋白质的分离纯化——分子量
主要内容
理化性质 蛋白质分离纯化 蛋白质浓度测定 蛋白质印迹实验 酶联免疫吸附实验 免疫沉淀 其他
理化性质
氨基酸——多肽链——蛋白质 一级结构、二级结构、三级结构、四级结构 分子量 等电点 活性
蛋白质分离纯化
蛋白质的分离纯化
溶解度 分子量 所带电荷 特殊亲和性
度梯度离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料 的密度梯度。
可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。。
蛋白质的分离纯化——分子量
凝 胶 过 滤
也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分 离蛋白质最有效的方法之一。
原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠 孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在 凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运 动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子 后流出柱外。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与无机盐为主的小分子分开，经 常和盐析、盐溶方法联用。在进行盐析或盐溶后，这两种方法除去引 入的无机盐。
蛋白质的分离纯化——分子量
离 心
经常和其它方法联用的一种分离蛋白质的方法。 蛋白质和杂质的溶解度不同时，可利用离心进行分
离。 蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密
蛋白质的分离纯化——溶解度
影响因素
pH值 离子强度 介电常数 温度
同一条件下,不同的蛋白质因分子结构的不同而有不同 的溶解度。根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条 件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度, 达到分离纯化蛋白质的目的。
蛋白质的分离纯化——溶解度
等电点沉淀
透析
将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行 分离。
超滤
利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被 截留在半透膜上的过程。
由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度 减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选 择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。
• 对比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl，同样浓度的二价 离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响 更明显。
• 盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸 钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用 于生产。
• 利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析 或凝胶过滤的方法除去中性盐。
带有正电荷的阴离子交换树脂 带有负电荷的阳离子交换树脂。
蛋白质的分离纯化——所带电荷
电泳
在外电场的作用下, 不处于等电点状态的蛋白质分子将向着与其电 性相反的电极移动。
聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 双向电泳
离子交换层析
是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平 衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方 法
• 冷乙醇分离法最初用于免疫球蛋白的提取，是目前 WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法。分辨率高、 提纯效果好。
蛋白质的分离纯化——溶解度
双水相萃取技术
• ATPE（Aqueous two phase extraction）, 是指亲水性聚合物水溶液在一定 条件下形成双水相,被分离物在两相中分配不同便可实现分离。此方法可 以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率 较高。
蛋白质的分离纯化——溶解度
有机溶剂提取法
• 与水互溶的有机溶剂能使蛋白质在水中的溶解度显著 降低。
• 室温下,有机溶剂使蛋白质沉淀的同时伴随着变性。 将有机溶剂冷却, 加入时不断搅拌防止局部浓度过高。
• 对于和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不 溶于水的蛋白质,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂 提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的 提取液。
目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺 凝胶和琼脂糖凝胶等。
蛋白质的分离纯化——所带电荷
电泳
在外电场的作用下, 不处于等电点状态的蛋白质分子将向着与其电 性相反的电极移动。
聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 双向电泳
离子交换层析
是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平 衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方 法
带有正电荷的阴离子交换树脂 带有负电荷的阳离子交换树脂。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺聚合形成网状结构。 分子筛效应 调节浓度可控制孔径大小 与所带电荷、分子量大小有关
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）
在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态。 依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的
常
pH值调节
用
方
盐溶和盐析
法 有机溶剂提取法
萃取法
பைடு நூலகம்
蛋白质的分离纯化——溶解度
等电点沉淀 • 不同蛋白质的等电点不同,而蛋白质在
其等电点时溶解度最低。
pH值调节 • 有些蛋白质在特定pH值时溶解较高，
因而可以通过调节溶液的pH值来分离 纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化——溶解度
盐溶和盐析
• 中性盐可显著影响球状蛋白质溶解度。增加蛋白质溶 解度的现象称盐溶,反之为盐析。
电荷量而逐渐呈梯度分开。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）