化学与生物工程2008,Vol.25No.5综述专论 Chemistry &Bioengineering1 收稿日期:2008-01-08作者简介:周晋武(1978-),男,湖北红安人,硕士研究生,主要研究方向:生物催化手性合成;通讯联系人:汪钊,教授。
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阿伐他汀手性中间体合成研究进展周晋武,汪 钊(浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州310014) 摘 要:综述了近年来阿伐他汀手性中间体的合成研究进展,从手性池反应、不对称合成、外消旋体拆分三个方面介绍了阿伐他汀手性中间体合成的工艺路线和研究水平,对其工业化前景进行了展望。
关键词:阿伐他汀;手性;42氯232羟基丁酸乙酯;手性池反应;不对称合成;外消旋体拆分中图分类号:TQ 463125 O 6231624 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2008)05-0001-04 他汀类药物是目前世界上十分畅销的调血脂药物,是HM GCoA 还原酶抑制剂。
对心血管疾病分子水平的研究表明[1],HM GCoA 还原酶是胆固醇生物合成的限速酶,任何影响此酶合成或功能表达的因素都能有效抑制胆固醇的合成。
他汀类药物正是通过抑制HM GCoA 还原酶与底物的结合来抑制胆固醇的合成,同时,他汀类药物还可以降低低密度脂蛋白(LDL )和甘油三酯(T G )、升高高密度脂蛋白(HDL ),从而对动脉粥样硬化和冠心病的防治有重要意义。
其中,由辉瑞公司开发的阿伐他汀,自1997年在美国和德国上市以来,销售额逐年攀升,2004年达到10618亿美元,成为首个年销售额突破百亿美元的处方药[2]。
阿伐他汀专利保护期到2009年9月止[3],目前国内调血脂药市场仍以辛伐他汀为主,然而,阿伐他汀因其适应症更广、耐受性和安全性更好已经引起国内各制药企业的广泛关注,学术界也对其生产工艺特别是重要中间体的合成展开了多方面的研究,作者在此综述了近几年国内外在这一领域的研究进展。
阿伐他汀结构式如下:其手性侧链有两个羟基,是与HM GCoA 还原酶识别的药效团,合成该侧链涉及的关键中间体主要有(S )242氯232羟基丁酸乙酯(42Chloro 232hydroxybutanoate esters ,C HB E )、(R )242氰基232羟基丁酸乙酯和(3R ,5S )262氯二羟基己酸叔丁酯,其结构式如下:按照合成过程中引入手性的方法来分类,合成阿伐他汀手性中间体主要包括:手性池反应、不对称合成和外消旋体拆分三种途径,分述如下。
1 手性池反应手性池反应本身并不涉及手性的改变,而是通过从手性池中选择合适的手性化合物作为原料制备目标产物。
所谓“手性池”,既包括来源于自然界的多糖、单糖、氨基酸等天然手性分子,也包括用人工方法大规模合成的手性砌块。
111 以手性32羟基2γ2丁内酯为原料合成手性(R)242氰基232羟基丁酸乙酯Hollingswort h 等[4]从手性32羟基2γ2丁内酯开始,经过开环、酯化和氰化制备得到(R )242氰基232羟基丁酸乙酯,初产率为90%。
美国S K 能量化学公司的研究人员发现[5],上述方法应用在工业规模生产中,乙酸中30%HBr 溶液的利用受到限制,并且由于使用乙酸,生成了产率为3%～10%的副产物42羟基丁烯酸乙酯,而通过选用乙酰溴作为酰化剂并控制反应p H 值8～915,可显著减少副反应,使42羟基丁烯酸乙酯含量低于2%。
112 以手性环氧氯丙烷为原料合成手性(S)242氯232羟基丁酸酯赵诚昱等[6]以手性环氧氯丙烷为原料合成了手性(S )242氯232羟基丁酸酯,由手性的环氧氯丙烷经过氰化开环和腈水解然后酯化而得。
研究了p H 值对氰化开环反应的影响,发现当反应溶液为酸性时,生成大量的3,42二羟基丁腈和1,32二氯异丙醇;当反应溶液为碱性时,则容易产生3,42环氧丁腈,后者可进一步转变为42羟基巴豆腈。
为了尽量减少副反应的发生,氰化开环反应的p H 值宜控制在713～718。
而在酯化反应中,将42氯232羟基丁腈溶解在醇溶剂中并鼓泡通入HCl 气体,就可以迅速地制备需要的高纯度羧酸酯。
2 不对称合成不对称合成是用手性催化剂或酶诱导非手性底物直接向手性产物转化。
这种方法理论转化率达100%,且无需手性原料,其优点显而易见。
211 还原酶选择性还原42氯乙酰乙酸乙酯(COBE)应用此方法制备手性C HB E ,反应体系中均需要加入NADP 、葡萄糖脱氢酶和葡萄糖以完成辅酶的再生循环。
由于酶催化还原反应所用的酶要从微生物细胞中分离纯化得到,而且反应必须添加昂贵的辅酶才能进行,工业应用较少。
通常采用微生物整细胞催化COB E 的不对称还原,如Chart rain 等[7]从400株酵母菌中筛选得到了一株木兰假丝酵母(Candi da m agno 2li ae ),在水/乙酸正丁酯两相体系中,在添加葡萄糖、NADP 和葡萄糖脱氢酶以及控制反应过程p H 值的条件下,产物(S )2C HB E 在有机相中的积累浓度可达90g ・L -1,光学纯度达到9616%ee 。
相近条件下,以表达了葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌细胞代替葡萄糖脱氢酶,与Candi da m ag noli ae 细胞混合,在水/乙酸正丁酯两相体系中催化COB E 的不对称还原,能使90g ・L -1的底物以化学计量比转化成(S )2CHB E ,产物的光学纯度达到96%ee [8]。
这些是目前产COB E 还原酶的非基因工程菌细胞催化还原COB E 制备手性C H 2B E 水平最高的报道。
江南大学的孙志浩课题组选育了高立体选择性和还原活性的菌株出芽短梗霉(A u 2reobasi di um p ull ul ans )CGMCC1244,分别研究了在单一水相体系和水/有机溶剂两相体系中的不对称还原,在没有添加辅酶和葡萄糖脱氢酶的条件下,产物(S )2CHB E 在单一水相体系中的浓度可达2013g ・L -1,在两相体系中的浓度达到了5618g ・L -1、转化率为9415%,产物的光学纯度均大于9717%ee [9,10]。
212 还原酶立体选择性还原62氯23,52二氧代己酸酯 Wolberg 等[11,12]利用短乳杆菌(L actobacill us brevis )中的脱氢酶(AD H )立体选择性还原62氯23,52二氧代己酸酯(1)的52羰基得(S )22(光学纯度9915%ee ,收率72%)。
进一步用化学法立体选择性还原(S )22的32羰基,生成(3R ,5S )23(光学纯度>9915%ee ,收率62%);如用Baker 酵母菌也可立体选择性还原化合物1,但生成(S)22的对映异构体(R)22。
Amidjo2 jo等[13]从植物Kefir中分离到一种乳杆菌L actoba2 cill us kef i r,具有两个脱氢酶,可将化合物1中的3位和5位羰基立体选择性还原成羟基,制得(3R,5S)23 (光学纯度>99%ee,收率85%)。
213 腈水解酶区域选择性水解32羟基戊二腈英国剑桥科技园的Dowp harma手性技术公司开发了一种以廉价的外消旋环氧氯丙烷为原料生产(R)242氰基232羟基丁酸乙酯的方法[14],其产物总收率为23%、光学纯度为9818%ee、化学纯度为97%。
其中关键步骤是利用腈水解酶的区域选择性催化能力使32羟基戊二腈去对称化。
反应条件经优化后,酶催化反应的底物浓度达到330g・L-1,转化率达100%。
3 外消旋CHBE的手性拆分外消旋体拆分是通过手性试剂或酶选择性地与一对对映体中的一个反应,然后分离底物或产物,从而达到拆分的目的。
这里主要介绍几种生物催化拆分外消旋体CHB E的方法。
311 脂肪酶催化的氨解反应Garcia2Urdiales等[15]用从Candi da ant arctica中得到的Lipase B催化C HB E的不对称氨解,生成(S)2 42氯232羟基丁酰胺,得到的(R)2C HB E的光学纯度达到了98%ee。
金勇等[16]用商品化的脂肪酶No2 vazym435,以二氧六环作溶剂,利用氨基甲酸铵缓慢分解持续释放N H3,不对称氨解拆分CHB E,底物浓度达到80g・L-1,30℃反应35h,R构型底物的光学纯度为99%ee、转化率为5717%。
312 脂肪酶催化的转酯反应黄泱等[17]用脂肪酶非水相催化C HB E的转酯反应,动力学拆分得到了对映体过量值为50%的(R)2CHB E。
类似地,Hoff等[18]在溶剂苯中,以丙酸乙烯酯为酰基供体,以R hi z om ucor miehie Lipase催化CHB E的不对称转酯化,较成功地拆分了C HB E,转化率可接近理论值50%,两个对映体的光学纯度均大于85%ee。
313 脱卤酶催化的脱卤环合反应Shimizu等[19]筛选到一株肠杆菌Enterobacter DS2S275,对外消旋的42氯232羟基丁酸甲酯进行不对称转化,可以同时得到光学纯度大于99%ee的(R)242氯232羟基丁酸甲酯和光学纯度为9519%ee的(S)232羟基2γ2丁内酯,两个对映体的转化率均达到48%。
该工艺已应用于15kL规模的工业生产。
随后Tsushi 等[20]对催化该反应的脱卤酶的编码基因进行了测序,发现该基因包含1101bp,内含一段与酯酶和脂肪酶相似的保守序列。
在此基础上,他们成功构建了转基因工程菌Escherichi a coli D H5α,与Enterobacter DS2 S275相比,该基因工程菌可提高反应速度近20倍,并且使耐受底物含量由8%提高到15%。
4 结语手性池反应合成阿伐他汀手性中间体易于实现工业化大规模生产,是目前国内企业采用的主要方法,但由于手性原料如(S)232羟基2γ2丁内酯和(S)2环氧氯丙烷的价格较高,占生产成本较大比重,限制了该方法的进一步发展。
生物催化的选择性还原方法,国内外研究得较多,从酶的生产、基因工程、催化条件等多方面都有详细的研究,是目前生物催化方法应用于工业生产比较成熟的方法。
其缺点是辅酶再生成本较高。
生物催化的外消旋体拆分方法多种多样,其中脱卤拆分工艺已经在瑞士实现工业化生产,而国内氨解拆分工艺也已经申请专利,达到工业化生产要求,目前这方面的研究方兴未艾。
随着阿伐他汀专利保护期的临近,竞争也日趋激烈,加紧完善易于工业化生产的方法和研发新的生产工艺具有现实意义。
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