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质粒提取试剂盒说明书

质粒抽提:
质粒抽提方法即去除RNA,将质粒与细菌基因组DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。

实验原理:
提取质粒DNA的方法有很多种,从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取,从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取,从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等,各种不同的方法各有其优缺点,根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。

详细内容请参考《分子克隆实验指南》。

另外,复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章,提供了质粒提取机理的详细解说。

碱裂解法
人们使用碱与SDS裂解法从E. coli(大肠杆菌)中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。

将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中,会使细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性,将质粒DNA释放到上清中。

尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏,闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离,这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。

只要OH-处理的强度和时间不要太过,当pH值恢复到中性时,DNA双链就会再次形成。

在裂解过程中,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物,后者被十二烷基硫酸盐包盖。

当用
K+取代Na+时,复合物会从溶液中有效地沉淀下来,离心除去变性剂后,就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

在SDS存在的条件下,碱水解是一项非常灵活的技术,它对E. coli的所有菌株都适用,并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL 以上。

煮沸法
煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中,然后加热到100℃使其裂解。

加热除了破坏细菌外壁,还有助于解开DNA链的碱基配对,并使蛋白质和染色体DNA 变性。

但是。

闭环质粒DNA链彼此不会分离,这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。

当温度下降后,闭环DNA的碱基又各就各位,形成超螺旋分子,离心除去变性的染色体DNA和蛋白质,就可从上清中回收质粒DNA。

煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效,可用于提取少至lmL(小量制备),多至250mL(大量制备)菌液的质粒,并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。

但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株,则不推荐使用该法。

这是因为碳水化合物很难除去,会抑制限制酶和聚合酶活性。

若碳水化合物的量很大,在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。

大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株(其中包括TGl)能产生大量的碳水化合物,不适于用煮沸法裂解。

质粒小提试剂盒
用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取,它结合了优化的碱裂解法,以及方便快捷的硅膜离心技术,具有高效,快捷的特点,能在30min内完成全部操作。

利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA
(OD260/OD280=1.7-1.9),此质粒DNA可直接用于DNA序列分析,各种酶促反应,PCR以及部分细胞系的转染等。

原理:
其中用到三种溶液以及硅酸纤维膜(超滤柱)。

溶液Ⅰ:50 mM 葡萄糖/ 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA,pH 8.0;溶液Ⅱ:0.2 N NaOH / 1%SDS;溶液Ⅲ:3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%酒精。

溶液Ⅰ
葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部;EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性;可添加RNase A 消化RNA。

溶液Ⅱ
此步为碱处理。

其中NaOH主要是为了溶解细胞,释放DNA,因为在强碱性的情况下,细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。

SDS与NaOH联用,其目的是为了增强NaOH的强碱性,同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。

这一步要记住两点:第一,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA会断裂。

溶液Ⅲ
溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。

其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS,因为十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassium dodecylsulfate, PDS),而PDS是不溶水的,同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。

2 M的醋酸是为了中和NaOH。

基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100 kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了,所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase;同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上。

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