需氧菌
苛氧菌
MH肉汤或琼脂
嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base +补充因子SR158
链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血
卡他莫拉菌属： MHA琼脂+5%脱纤维 羊血
淋球菌：CC Agar Base+L53
厌氧菌 Wilkins chalgren anaerobe 琼脂
测试菌液的点种2
开启多点接种器进行点种，因每一根点种 针直径约3mm,因此点种到药物平板上每点 的菌液量约为2ｕl，所以接种量为104 CFU/ 点 点种时应先点种对照前的质控平板，然后 从最低药物浓度开始点种依次点种到药物 浓度最高的平板
药物平板的孵育
上述接种好的平板应在室温下静臵至接种点上的 菌液被琼脂完全吸收，再将药敏平皿倒臵，于 35℃孵育16-20小时 如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，则需33-35℃， 绝对不能超过35℃，孵育24小时，阅读结果 万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵24 小时后，阅读结果 淋病奈瑟球菌需在5%CO2空气环境中孵育20-24小 时，阅读结果
琼脂稀释法药敏平板的制备4
准备2只无药的平板,作点种前和点种后质 控对照 所有药物平板应保持表面干燥,不可有肉 眼可见的水珠(可在35℃孵箱内倒臵平板 开盖烘干15-20分钟)
琼脂稀释法药敏平板的制备5
如果需使用的药物平板为100Χ100mm的方平板, 则 每根玻璃管内需加入2.5ml的抗菌药物稀释液； 每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4.5ml 每只方平板应加入2ml抗菌药物试液 无菌吸管内应存留下2.5ml与下一个浓度的玻璃 试管内的2.5ml稀释液进行充分混匀 药敏培养基应加入28ml
琼脂稀释法药敏平板的制备2
取11支无菌玻璃试管(13Χ100mm),每支试 管标记为： 960,480,240,120,60,30,15,7.5,3.75,1. 875,0.935ｕg/m,并于上述每根管子中用 无菌移液管加无菌稀释液1.5ml
琼脂稀释法药敏平板的制备3
将保存在≤-20℃冰箱中的1920ｕg/ml浓度的抗 菌药物保存液取出融化后,用无菌移液管吸取 2.5ml加入到128ｕg/ml标记的平板内1ml 移液管内剩余的1.5ml加入到960标记的试管内, 混匀后再吸取2.5ml加入到64ｕg/ml标记的平板 内1ml 移液管内剩余的1.5ml再加入到480ｕg/ml标记 的玻璃试管内;混匀后再吸取2.5ml 依次类推,直至最后一个0.06ｕg/ml标记的平皿 内加入1ml,则抗菌药物稀释完成
抗菌药物保存液的准备1
估算抗菌药物最小称量 琼脂稀释法最高药物浓度为128ｕg/ml 药物和培养基的体积比1:14,即药物浓度将成 15倍稀释，因此保存液为 128ｕg/mlΧ15 = 1920ｕg/ml 如果1次用量为10ml ,则: 抗菌药物最小称量= 1920ug/ml*10ml
菌液准备1
生长法： 无菌环取4-5个菌落大小形态一致的菌落 顶部后接种于4-5mlMH肉汤内 35℃ 培养4-6小时到对数生长期，亦可过 夜培养,但不允许超过18小时 用肉汤/生理盐水校正至0.5麦氏管浓度12X108CFU/ml
菌液准备2
直接菌落悬浮法： 从孵育了18-24h新鲜培养物的平板上，用 无菌环取单个菌落 接种于无菌肉汤/生理盐水内 校正至0.5麦氏管浓度1-2X108CFU/ml 推荐用于苛氧菌和潜在的MRS
测试菌液的点种1
预先将点种针和点种板高压灭菌,并在孵箱内烘干 （52孔、100孔、或21孔） 将已调整好浊度(1-2Χ107CFU/ml)的菌液用微量 加样器将菌液依次加入菌液点种板小孔内,并作好 与药物平板相应的点种标记,一般每小孔内应加入 菌液270ｕl。每批试验均须保留有质控菌位臵和 无菌菌液位臵 用酒精棉球清洁多点接种器后，将点种针安装在 多点接种器架子上，再将加好菌液的点种板安臵 上多点接种器的点种板位臵上
喹诺酮类
MIC太低
培养基PH太高
多种药物
跳管
污染、管内接种物不 重复QC试验 正确、药物浓度错误、 使用新批号培养基 肉汤体积错误
抗菌药物最小称量=
结果阅读和判断
结果阅读时，平板应臵于黑色不反光的表面上， 记录的MIC是完全抑制细菌生长的最低抗生素浓度， 单个菌落或接种物所致的轻微的不清晰现象可忽 略不计。 如果在MIC判断终点附近持续存在或多个菌落，或 者低浓度不长，高浓度生长；或者有俗称的跳管 现象，就应该检查试验菌的纯度，有否污染菌生 长，并尽可能重复试验。 按当年的CLSI/NCCLS标准判断结果。
质
控
菌
株
药敏 其他
质控菌株
金黄色葡萄球菌
ATCC29213 ATCC25922 ATCC35218
+ + + + +
产β内酰胺酶
大肠埃希菌 大肠埃希菌
肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌
ATCC700603 ATCC27853
产超广谱β内酰胺酶
质
控
菌
株
药敏 其他
质控菌株
肺炎链球菌 粪肠球菌
ATCC49619 ATCC29212 ATCC49766 ATCC49247
琼脂稀释法操作步骤
原理：
将抗菌药物配制到琼脂培养基中成：128ｕ g/ml 、64ｕg/ml 、32ｕg/ml ……0.06ｕ g/ml对倍稀释的浓度系列 多点接种器将制备好的细菌菌悬液迅速点 种到琼脂表面,经35℃16-20小时培养 肉眼观察细菌生长,以未见细菌生长平板的 最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)
琼脂稀释法药敏平板的制备 1
配制融化的MH琼脂或适合其他苛氧菌、厌 氧菌等特殊细菌的培养基,待冷却到4850℃，浇制药物平板。 取灭菌的90mm平板12只,用记号笔在平板 底部作好“点种标记”、“药物名称”、 “药物浓度”,浓度从0.06ｕg/ml……128 ｕg/ml,每种浓度1只平板共12个浓度系列。
抗菌药物的效价
抗菌药物保存液的准备2
抗菌药物稀释 选择合适的抗菌药物稀释液进行药物稀释, 稀释液需要量见下列公式：
稀释液体积=
抗菌药物实际称量*效价
保存液浓度（1920ug/ml）
抗菌药物保存液的准备3
实际操作： 先计算完成一批试验需几次完成,每次用 量多少,然后可一起称量,一起稀释,然后 按每次需要量分装在试管中,贴上标签,注 明药物名称,浓度,体积数及配制日期,臵 与≤-20℃保存,备用。
菌液准备3
对绝大多数细菌来说,上述用生长法或直 接菌落悬浮法制备的0.5麦氏浊度的菌悬 液,应该再用无菌肉汤或生理盐水行1:10 稀释,此时菌液浓度为1-2*107CFU/ml,调 整好的菌液应该在制备后的15分钟内完成 点种
菌液准备4
如一次实验需完成50株或100株细菌,则细 菌要编上工作序号1-50或1-100,并在结果 记录纸上要一一对应写上工作序号和菌种 编号
+
+ + + +
检测胸腺嘧啶 氨苄西林敏感株 产β内酰胺酶(-) 氨苄西林耐药株
流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌
淋病柰瑟球菌：
厌氧菌
ATCC49226 ATCC25285
常见问题及解决指南
抗菌药 现象 可能原因 解决办法
氨基糖苷类
MIC太高
培养基PH太低
PH范围7.2-7.4。避 免CO2孵育降低PH PH范围7.2-7.4。