将1mL酶溶液溶于适当缓冲液,加入含有750mg丙烯 酰胺(单体)和40mgN，N’—甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的 3mL溶液中，再加0.5mL 15％的二甲氨基丙腈(加速剂)， 同时，加入1％过硫酸钾(引发剂)，混合，于25C,保
温10min，便得含酶凝胶。 将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒,于低温储存或冷 冻干燥。 为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立 即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的 有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。
•
①重氮法：重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮
基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使
用最多的一种。 • 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共
聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
•
•
② 叠氮法： 即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分 子上的相应基团偶联成固定化酶。 带有羧基或羟基、羧甲基等的载体均可用。 首先在酸性条件下用甲醇处理使之酯化，再用水合肼处 理形成酰肼，最后在HNO3作用下转变成叠氮衍生物。此衍 生物在低温下可与酶蛋白的羟基、酚基或巯基等反应，但 产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与一NH+2反应。
溶的溶剂中,加入酶液后，再加入油溶性表面活性剂为 乳化剂使之乳化，再把它分散于含有保护性胶质如明 胶、聚丙烯醇和表面活性剂的水溶液中，第二次乳化。 在不断搅拌下，低温真空除去有机溶剂，便得含酶微 囊。 常用聚合体有乙基纤维素、聚苯乙烯、氯橡皮等， 有机溶剂有苯、环己烷和氯仿。
• ④红血球包埋法： • 在高渗溶液中红细胞膨胀伸展后，细胞内 血红蛋白漏出，同时胞外蛋白也能扩散进红血 球，再放进等渗溶液中，红血球膜又回复至正 常状态和透性，进入 • 的酶不会漏出来。
• 如，含有高浓度血红蛋白的酶溶液在与水不互溶、沸点比 水低的有机相中乳化，加入油溶性表面活性剂，形成油包
水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在搅拌下加入乳化
液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂,使高聚物 在油一水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，从而制成固 定化酶。 • 作为高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯 等。 •
加60mL酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，
再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶， 置4℃备用。
•
•
固定化ol/g· h湿固定化酶。
二、包埋法
• 包埋法（entrapment）是将酶包埋在高聚物
的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定 化方法。 • 前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型； • 后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶
同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；
固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省
去了热处理使酶失活的步骤； 稳定性显著提高； 可长期使用，并可预测衰变的速度； 提供了研究酶动力学的良好模型。
固定化酶的制备原则
• （1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构 象。 • （2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化 既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回 收贮藏，利于反复使用。
载体活化的主要反应：重氮法、叠氮法、溴化氰法、
芳香烃化法等。
(3)偶联反应 酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和 酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和的 pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行。
现已有许多种偶联反应都能制备固定化酶。
实际运用中必须考虑到酶的偶联效率,固定化酶总 活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素。
• ⑤脂质休包埋法：
采用双层脂质体形成极细球粒包埋酶。
• E.G.将卵磷脂、胆甾醇和二鲸腊磷酯按7：2：1溶于 氯仿中,再加入酶液，混合物在旋转蒸发器中，在氮 气下32℃转动乳化，然后在室温下保持2h，再在氮气 气流中,4℃用音波处理10s，在室温下保持2h，过 Sepharose 6B柱，收集脂质体，离心分离脂质体，所 得球粒悬浮于缓冲液中，继续音波处理，并过 Sepharose 6B柱，可得含酶的微囊。 • 当底物产物穿过与微囊液膜的径无关,但与产物 或底物对膜成分的溶解度有关。
(2)载体的选择 一般要求是: ①一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其 稳定性上都优于疏水载体。
②载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。 ③载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。
④载休没有或很少有非专一性吸附。
⑤载体来源容易．便便．并能反复使用。 • 酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧 基和羧甲基等。
②界面聚合法: 界面聚合法是将疏水性和亲水性单体在界面进行聚 合，形成半透膜,使酶包埋于半透膜微囊中。此法曾用 来制备Asn酶、脲酶等。 制备方法：将酶水溶液与亲水单体(如乙二醇)用一 种水不溶混的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一有 机溶剂疏水单体(如多异氰酸)溶液在搅拌下加入到上 述乳化液，便在乳化液中的水相和有机溶剂之间的界 面发生聚合化这样水相中酶便包埋在聚合体(聚脲)膜 内。
三、共价键结合法
• 共价键结合法(covalent binding）是将酶与聚合物载体 以共价键结合的固定化方法。
• (1)酶蛋白上可供载体结合的功能基团： • • • • ① 酶蛋白N末端的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基。 ②酶蛋白C末端的α-羧基、天门冬氨酸残基的β-羧基 以及谷氨酸残基的γ-羧基。 ③ 苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。 ④其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪氨 酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
平衡，能有效的包埋许多种酶。
• 同时、可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取物 或细胞，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞.
因此，此法在医疗上极为有用。
• 例如固定化天门冬酰胺酶(治疗白血病)就是用这种 方法制成的微胶囊。
微胶囊的制备方法:
• ①界面沉淀法:利用某些高聚物在水相和有机相的界
面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法。
发展现状
• 从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，但 已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技 术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上 使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄 糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个 酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶 和细胞能适用于工业规模生产。
固定化酶的优点
囊型。
•
（1）凝胶包埋法 –将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合促进剂 (包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中 以达到固定化。
–凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、
明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、 聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。
E.G.1 聚丙烯酰胺凝胶包埋
弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。
例如：用CNBr活化的琼脂糖固定化胰蛋白酶。
将Sepharose 4B 用蒸馏水洗净，含0.1g干物质的 湿胶加5mL水和4mL现配溴化氰水溶液(25mg/mL)，搅拌 下用2mol/LNaOH调pHll.0，23—25℃反应6min，抽干立 即用300mL 0.1mol/L NaHCO3洗净, (5—8min内完成)。 活化的载体用0.025mol/L pH10.2（含0.02mol/L CaCl2）硼酸缓冲液液快速淋洗后，用5m1缓冲液转入烧 杯内加16mg结晶胰蛋白酶，搅拌4h，用0.1mol/L pH8.5 硼酸缓冲液(内含1mol/L NaCl)洗涤后，复用pH4.1的醋 酸缓冲液洗涤，便制成了固定化胰蛋白酶。
第七章
固定化酶和固定化细胞
•
酶的比活力（specific activity）代表 酶制剂的纯度。
• 比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力 单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质 表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡 量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活 力越大，酶的纯度越高。利用比活力的 大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋 白质的催化能力，是表示酶的纯度高低 的一个重要指标。
•
•
③溴化氰法：即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生 物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。
• 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。 • 含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件
下，载体的羟基与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在
过去曾称其为水不溶酶或固相酶。
酶固定化技术发展史
• 1916年，Nelson和Griffin发现酶的固定化现象；
• 1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例；
• 1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一 的英文名称Immobilized Enzyme； • 1973年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产 L-天冬氨酸。 • 1986年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡 萄糖氧化酶等相继获得成功。
• 离子吸附法(ion adsorption)是通过离子键使
酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结
合的固定化方法。 • 离子吸附法具有操作简便、条件温和、酶活
力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可
以纯化酶。 • 此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。
• 离子吸附法常用的载体： • 阴离子交换剂：二乙基氨基乙基( DEAE）-纤维素、四 乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、 DEAE—葡聚糖凝胶等； • 阳离子交换剂：有羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬
•
（2）微胶囊包埋法
–微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜
微胶囊内的方法。 –它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的 脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶 的稳定性。
–常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸