激光诱变技术在生物育种中的应用摘要阐述了激光诱变技术的机理,介绍了激光诱变技术在农业育种、微生物育种和其他生物育种方面的应用成果,提出了激光诱变技术在生物育种应用中存在的问题并展望其发展方向。

随着激光诱变技术的发展,在激光生物工程技术(激光微束技术、激光细胞融合技术、激光导入外源基因等方面)基础上诱变育种工作提高到一个新的阶段激光微束技术是利用激光亮度高、光谱纯、可调谐、发散角小等固有特点,将激光束用光学系统聚焦形成非常细的光束,光斑直径小到甚至10-7m,并使之在细胞内聚焦而不破坏细胞膜,对细胞核和细胞器进行操作(如去掉细胞壁,进行细胞融台、切割染色体等)。

这种技术可应用于高等植物特别是农作物、植物染色体工程、基因定位及植物染色体片断DNA 的微克隆。

关键词激光诱变;机理;生物育种0引言激光诱变作为物理诱变的一种方式,其生物学效应直接来源于其产生的光、电、热、压力和磁效应的综合作用。

上述效应累积,使细胞DNA分子吸收、聚积能量并进行能量再分配,使细胞DNA处于一种易于突变的状态,继而发生一系列的诸如断联等物理和化学变化，键、聚合、交导致DNA分子结构的改变即DNA 分子的损伤和突变,最终引起突变株生物学属性变化[1]。

如果是控制某种代谢途径的酶系基因水平上的改变,则有可能增加某一特定代谢产物的积累[2]。

相对于传统的紫外诱变手段,激光诱变具有高效、稳定、高选择性、回复突变率低、定向变异率高、辐射损伤轻、当代变异、无污染等优点,并且激光还可促使作物增产、提高植物的光合效率、根尖有丝分裂频率等生物效应发生,而逐渐受到研究人员的关注。

激光对生物体作用的研究已有40多年的历史,随着科学技术的发展和研究水平的深入,激光诱变技术在植物及微生物诱变育种,品种改良的生产实践中得到了广泛推广和应用。

激光诱变技术在生物育种中使用的激光器种类繁多,波长从红外到紫外,几乎每一个波段的激光都有效果。

激光诱变育种常用的激光器及使用的频率详其中以CO2和He-Ne激光器最为常用光育种[3]。

它是一种新型的育种技术,育种当代即可出现显著效果有关激光育种刺激作用机理研究最初仅限于生物的外观形状,目前逐渐深入到生理生化及遗传效应的研究,为在农业育种上的应用奠定了基础。

1 激光诱变技术在农业中的应用1.1 粮食作物育种激光诱变技术在粮食作物育种方面的应用已有许多报道,其中比较显著的是在小麦、水稻等育种方面。

李成佐等 [4]采用N2激光和He-Ne激光辐照“绵阳21号”等四种小麦材料的干种子,利用生物统计和数量遗传学的方法对L和L2两代的株高、穗颈长等11个茎杆性状的遗传变异进行研究。

对不同的小麦干种子进行激光辐照,诱变后代的变异差异明显;激光种类对其后代变异差异不大;株高、穗颈长的遗传力较高,宜在早代进行选择。

陈怡平[6]等运用单纯的He- Ne 激光处理、单纯激动素(6-呋喃氨基嘌呤,KT)处理和He-Ne激光与激动素(KT)复合处理冬小麦种子,发现均能提高种子活力,He-Ne激光对促进种子萌发处理效果最好。

张俊国等[3,7]对吉粳88水稻种子及减数分裂期幼穗进行了不同波长、功率及照射时间的激光辐照处理,结果有的处理组合在M1和M2代均出现了变异株,其中早熟变异的出现频率最高达株数的75%,其次为粒重变异、芒性变异、穗粒数变异、着粒密度变异和株高变异,占变异株数的比例分别为67%、58%、58%、50%和42%,从而为水稻激光育种提供了必需的科学依据。

同时又对水稻吉粳88的糙米进行了不同波长、功率及时间的激光处理,1)在一定波长范围内,成苗率呈现增长、下降、又增长的趋势;2)在一定的时间范围内,成苗率呈现先增长再下降的趋势;3)在一定的功率范围内,成苗率也呈现先增长再下降的趋势,因此,选择合理激光处理参数对成苗率有重要影响。

对减数分裂期幼穗激光处理结果进行分析,显示品种性状在处理组合内大多数都出现了遗传变异,而且变异类型比较丰富,占全部变异株的 80%以上的为芒性变异,然后依次为着粒密度、粒长、熟期和株高, 数量性状中单株穗数变异频率最高, 其次为穗粒数, 千粒重变异频率最低, 各类变异为选育新品种奠定了基础。

由此说明激光诱变可以作为有效的育种新方法应用于水稻新品种选育。

1.2 经济作物育种我国进行激光诱变经济作物研究始于 20 世纪 70 年代初, 并相继在油菜、番茄、黄瓜、洋葱、蚕豆等方面取得重大进展。

侯丙凯等[5]利用激光微束穿刺法将苏云金芽孢杆菌的毒蛋白基因导入油菜。

实验证明抗虫基因已导入油菜基因组中并得到了稳定遗传, 这为人们利用基因工程手段进行油菜的抗虫育种奠定了基础。

邵耀椿等[6]将激光辐照外源 DNA 导入番茄, 并对细胞色素氧化酶同工酶进行分析, 受体后代与受体对照的同工酶图谱差异较大而与供体对照的同工酶图谱差异较小, 这与它们在叶形与生长型表达上的差异是吻合的。

这表明激光辐照外源DNA已经导入受体, 并得到整合表达, 为激光诱变番茄育种开拓了新方向。

刘永军等[7]用热活性检测系统测定了 He - Ne 激光辐照后黄瓜种子萌发过程的能量-时间曲线, 结果显示能量- 时间曲线、发芽势、发芽率及酶活性等都有相应变化, 并确立了最佳辐照时间, 从而为研究激光辐照后引起的生物学效应、研究种子萌发过程的规律、开发新品种提供了理论依据。

赵彤[8]采用 CO2 和He - Ne 两种激光的三种剂量, 分别辐照两个洋葱品种的湿种子, 利用生物统计学的方法从个体水平上考查了激光诱变洋葱 L2 代的鳞茎鲜重、横茎等主要性状的回归分析和遗传变异。

结果表明, 洋葱鳞茎的横茎、纵茎、单株生物产量与鳞茎鲜重间的回归关系显著, 横茎的作用大于纵茎, 育种中应重视鳞茎、横茎的选择。

张建东等[9]发现不同功率密度的 CO2 激光和激光的不同照射时间都对发芽率、淀粉酶活性、可溶性蛋白质、可溶性糖含量和氨基酸含量产生影响。

这些参数为进一步研究 CO2 激光辐照大豆的生物学效果提供了一定参考。

2 激光诱变技术在微生物育种方面的应用微生物在解决人类的生活条件和生存环境等问题中正起着越来越重要的作用。

微生物应用研究的难题在于怎样通过遗传育种方法获得高产的菌株。

人们在微生物遗传育种的研究中, 逐渐认识到激光诱变具有显著成效, 并现, 大剂量辐射可杀死或抑制细且在激光辐射微生物研究中发菌和病毒, 而用弱激光(小剂量)辐射可刺激某些菌类的生长和繁殖, 从而逐渐形成了一种独立的技术———激光诱变微生物技术。

但辐照所产生的刺激效应机制复杂, 难以从某一单一过程加以理解, 可以从物理、光照活化效应、化学等方面去解释[10]2.1 工业微生物育种激光作为一种微生物诱变因素, 已经在工业微生物育种中得到应用。

王雪松等[9]采用 He- Ne激光诱变茁芽短梗霉原生质体获取短梗霉多糖高产菌即普鲁兰高产菌, 为国内普鲁兰工业化生产提供了具有应用价值的菌株。

孙毅[6]应用低能氮离子注入和激光技术进行纤维素酶产生菌绿色木霉的育种研究见图 2) , 通过测定和分析其经诱变后产生的纤维素酶系中三种酶的活性, 得到了几株酶活有显著提高的菌株, 其中比较突出的是, 激光处理的菌株酶活提高了03.2%, 离子注入的酶活提高了108.8%, 张智维等[8]用 He - Ne 激光作为诱变光源照射啤酒酵母细胞, 在合适的时间和剂量下, 得到一株优良菌株。

用该菌株酿造的啤酒, 其双乙酰值为 0.1253 mg L, 比原菌株下降了 30%, 此方法可缩短啤酒发酵周期, 从而降低工业生产成本。

2.2 激光诱变技术在大型真菌育种方面的应用激光诱变技术在微生物育种方面成绩比较突出的是在大型真菌中的应用。

陈五岭等[7]为考察香茹变异株的遗传稳定性进行了实验。

对三株香菇菌种采用He - Ne 激光(波长 632.8 nm)进行两次照射, 筛选出三株比菌株菌丝生长速率分别提高 17.3%、 73.7%和 42.6%的变异株, 经传代培养及酯酶同工酶谱分析, 变异株具有良好的遗传稳定性。

说明 He- Ne激光诱变在香菇菌种选育中诱发突变作用显著。

超氧化物歧化酶是生物体防御氧化损伤的金属酶, 具有抗辐射损伤, 抗衰老、防治肿瘤、炎症等广泛的药用前景。

有关激光诱变选育微生物 SOD 高产株的研究, 尚未见报道。

李耀维等[3] 用 He - Ne 激光辐照诱变金针菇的原生质体、菌丝体片段, 分生孢子悬液, 并进行初筛、复筛及突变株遗传稳定性研究, 最后选育出一株SOD 高产株。

结果表明: 采用原生质体进行诱变, 其正突变率, 单株 SOD 产量提高率、产 SOD 遗传稳定性均高于菌系体与分生孢子。

也充分论证了激光诱变原生质体是获得金针菇 SOD 高产株的有效途径。

3 激光诱变技术在其他生物育种方面的应用随着激光诱变技术的发展, 我国科研工作者运用激光诱变技术在鱼类、畜牧、家禽育种等方面做出了巨大的贡献。

3.1 鱼类育种谭石慈等[5]采用不同波长、剂量的多种激光, 对锦鲫的受精卵进行多次重复辐照试验, 经过一年多的孵育苗实验和探索, 获得了一个由单尾变成双尾、体色多种、观赏价值大大提高的鱼类新品种, 该研究成果通过了鱼类育种专家的鉴定, 并命名这个新品种为中华彩鲤。

何家林等[6]用He- Ne 激光辐照金鱼受精卵和胚胎孔雀鱼, 导致两种鱼胚胎畸变, 且金鱼胚胎的畸变率与辐射剂量的有密切关系。

随着激光微束在育种中的应用, 研究人员开始运用激光微束在鱼类受精卵上打空, 倒入外源基因, 具有定位准确、操作简便、可对靶体进行选择等优点, 是进行鱼类育种的新途径。

3.2 牲畜育种激光诱变技术在牲畜育种方面的应用主要是用激光照射动物的生殖细胞以取得有益突变。

其研究始于 1969 年, 目前已用激光照射多种家畜的精子以提高精子活力, 延长精子寿命。

用激光照射与人工选育相结合, 有可能培育出家畜的优良品种。

陈恒雷等[7] 介绍了一系列激光辐射动物生殖细胞从而达到有益突变的例子4 结束语到目前为止, 将激光诱变技术应用于农作物、微生物育种及食品工业等有了长足发展, 但激光诱变的微观机理有待进一步研究, 而且激光辐照诱变微生物变异菌株不稳定, 传代四、五代后便逐渐退化;随着激光诱变技术的发展在激光生物工程技术(激光微束技术、激光细胞融合技术、激光导入外源基因等方面) 基础上诱变育种工作提高到一个新的阶段激光微束技术是利用激光亮度高、光谱纯、可调谐、发散角小等固有特点, 将激光束用光学系统聚焦形成非常细的光束, 光斑直径小到甚至10- 7 m, 并使之在细胞内聚焦而不破坏细胞膜, 对细胞核和细胞器进行操作(如去掉细胞壁, 进行细胞融台、切割染色体等)。

这种技术可应用于高等植物特别是农作物、植物染色体工程、基因定位及植物染色体片断DNA 的微克隆。