液相色谱-质谱联用仪的使用（Agilent LC-QQQ6490 ）文件编号：版次/修订次：编写：日期：审核：批批准日准：期：修改修改文件修订记录表修改批准批准序号章节号修改内容申请人人日期初稿1 初版制作。

作成年xx 月xx 日主要内容：仪器型号Agilent LC-QQQ6490硬件组成色谱系统、质谱系统软件组成数据采集系统、定性软件、定量软件方法建立材料的准备、初步方法的建立、方法的优化关机三大步一、仪器硬件组成1. 色谱系统1.1 流动相A.水溶剂：A1 ：纯水（避光，常更换，防止细菌滋生）A2 ：甲酸水、氨水等B.有机溶剂B1 ：纯乙腈、纯甲醇、纯异丙醇B2 ：含0.1% 的甲酸乙腈溶液注：流动相越简单越好，避免加入无机盐（如HSO 4）2甲醇与乙腈的比较：甲醇：与水相溶会发热；延滞性大，便宜；乙腈：溶解性不佳，乙腈会结晶；极性、溶解性和延滞性极性：水> 甲醇> 乙腈；延滞性（表面张力）：水> 甲醇> 乙腈；洗脱能力：甲醇、乙腈> 水流动相的配置：水相流动相通过0.22 μm 的膜以达到去除颗粒的目的。

超声（10 ~ 20min ）以去除气泡；滤头应定期更换1.2 色谱柱保护套（滤头、套管）注：进口：用扳手拧，出口管路应多留出一段），安装柱子时应避免这段管路。

色谱柱的冲洗：先用一定比例的流动相冲洗，再用纯有机溶剂进行冲洗；不用时，一般保存在规定的有机溶剂中。

C18 柱（农药、兽药）：吸附中弱极性的物质；亲水性柱：三聚氰胺、PSP 柱规格：10 cm ×2.4~3.0 μm，0.2 ~0.3 mL/min ；5 cm ×1.8 μm 0.2 mL/min ，其中柱压一般不超过350 bar.一旦出现：柱压高：堵塞（系统+柱子）；柱压低：漏气（系统+柱子）1.3 六通阀装样位置进样位置泵（流动相）1 21 26色谱柱3排放6 354进样针54定量环1.4 梯度洗脱CBA D注：从低比例有机溶剂的流动相开始，更改比例，但不要改变流速。

阶段A ：现将柱子里、管路中极性杂质先冲出，如水中的极性物质；阶段B: 有机溶剂比例的提升阶段，分离被测液中的各组分，加强被分离组分与流动相的作用力；对于多组分的分离，更改梯度的斜率，但都是使有机溶剂的比例；阶段C ：稳定阶段：要有足够的时间使众多的弱极性杂质；阶段D ：为下一针做着准备。

2. 质谱系统2.1 主要部位（接口，其作用是离子化、气化和去溶剂）APCI: 大气压化学离子化（甲烷气），间接电离的过程ESI: 电喷雾离子源，既是接口装置，又是离子化装置雾化器电喷雾离子-4000v 溶剂喷雾加热氮气干燥气毛细管口离子源结构图+ [ 加 H 离子化 ] [M+1]+e.g.300+1解释了流动相加酸的原因ESI- [ 去 H 离子化 ] [M-1] e.g. 300-1 纯流动相+2.2 真空系统机械泵（ 10-4 Torr ），作用于离子源，去杂质；分子涡轮泵（ 10 -5 Torr ）在三重四级杆的中间加两个2.3 质量分析器四级杆的结构图注： LC-MS 对手性物质较难分离，一般使用手性柱。

质谱的完整结构图2.4 离子扫描方式（1））Scan( 全扫描模式)：需要设定一个扫描范围，如m/z:100~500（2））SIM( 离子选择性扫描模式)：一个四级杆设定一个电压（即参数），如m/z=300（3））Product ion ：SIM + Scan （提高质谱仪电压）↓↓选择母离子筛选出子离子（100 ~ 略大于母离子）(4) MRM （多反应监测）:SIM+SIM ，只出现在多级质谱中:二、仪器软件组成（具体操作过程见文件2）1. 数据采集软件2. 定性分析软件3. 定量分析软件三、仪器方法的建立1. 一般性操作过程1.1 明确目标物，通过文献的搜集，整理出目标物的质谱参数（碰撞能、母离子、子离子及加速电压等）以及色谱系统中的梯度程序；1.2 确定色谱系统中的流动相和色谱柱等并准备好；1.3 目标物的单标及混标的配置，配置完成以备用；1.4 仪器方法的建立1.4.1 先进行目标物单标的质谱参数确定（无需连接色谱柱）1.4打开数据采集软件：（Data Acquitation Mass Hunter ，在线软件中正上方调出“HJJ.Method ”文件夹中的“OPTIMIZE.m ”方法）1.42在窗口下面的Sample Run 中进行编辑:样品信息（Sample ）Position （样品位置）；Injection Volume （进样体积）；数据文件信息（Data file ）Name （文件名）和Path （数据文件的存储路径）1.43母离子的确定①打开Method Editor 对话框，点击QQQ 选项设置各参数，扫描方式：scan②运行：Apply ；start③运行完毕后，在DA 位置点击View Date 查看数据，进入Qualitive Analysis 离线软件界面。

在Qualitive Analysis 离线软件中自动跳出TIC 总离子流图如下图所示选择双向箭头图标，选取最高峰前后（任何位置出现的子离子均相同，只是响应强度不一）的一段范围，双击左键，在离子流图底下弹出丰度-质荷比图。

查看是否出现文献中所示母离子，若有进行下一步，若没有再查找其他文献。

1.4子离子的确定① 关闭Qualitive Analysis 离线软件，回到Method Editor 中的QQQ 界面② 设置质谱参数：包括扫描方式（Product ion ）、加速加压母离子、扫描范围(根据相关文献确定范围，需注意，子离子扫描范围应将母离子包括在内) 和扫描时间及碰撞能的③运行：Apply ；StartG. Qualitive Analysis （同1.4.1.3 中的步骤③）左键：选择谱图上的一段；双击，找子离子注：查看是否出现文献中所示子离子时，若有记录子离子与响应程度最高时的碰撞能。

若无可自行选取核实的m/z 作为子离子，根据响应程度选择合适的碰撞能，最终记录相关信息。

确定子离子的依据：首先在各质谱图中找出响应较高（丰度比大）的离子，在对比不同碰撞能条件下的各离子的响应程度。

A1.4.2 将质谱参数添加至方法中在 Method Editor中新建一方法， QQQ 选项中设置以下质谱参数①离子源（ Ion source ） :ESI ；②Time segment③ Scan Segments ：注：调整 Dell 使得 Cycle/s ≥1 ，选择 Unit 模式，点击 Apply④Source : 实际值与默认值要一致⑤保存 (路径 )1.4.3 色谱参数的确定 （添加目标物的混标进行色谱参数的确定） 梯度洗脱程序的设定 1.4.3.1. 在 Method Editor中 的 Binary Pump 选项中进行编辑（1 ）选择合适的流动相及流速(2) 编辑洗脱程序在 Timetable(x/100events)窗口梯度程序的设定（3 ）设置流动相参数Flow( 改流速 ) mL/min1,2Solvent设置参数时要选定参数B1,2Pressure Limit： Min:0.00 barMax:550 barSample name Sample position Method Data File ×××Script:. ....... （添加一个事件，让仪器终止、稳定 )保存1.4.4.1 暂停流动泵，换柱子dcab保存，修改 Stop time :30min( 与梯度洗脱程序时间一致 ) Postime: off1.4.3.2. 在 Method Editor 中 的 Hip Sample 选项中进行进样针的吸取速度、注射速度、吸取深度与平衡时间等的编辑如： Draw Flow ： 200 μL/min ；其他不变C. 在 Properties 中填写储存路径，保存方法1.4.4 运行方法Worklist ：新建工作表S07 P1-F9 LSY/20150125PEST-P1-F9---No Injection....WASH-1.4.5 洗脱程序的优化使梯度程序时间尽量缩短，并使各物充分分离，并有足够强的响应程度LC-MSMS 的方法建立完成2. 实例说明（以四种磺胺类样品为例进行本仪器的方法建立过程说明）以四种磺胺类样品的方法建立为例）2.1 材料的准备（磺胺类单标与混标的配制）（1））试剂准备：溶剂：甲醇（应与原样品一致）；单一标准品：磺胺二甲异恶唑（1000ppm ）、磺胺嘧啶（1000ppm ）、磺胺甲基嘧啶（1000ppm ）和磺胺二甲异嘧啶纳（1000ppm ）；进样瓶（标签内容： e.g. 名称:磺胺嘧啶；浓度：1000ppm ；日期：2015.01.24 ）；（2））仪器工具：移液枪、2mL 一次性注射器、0.22 μm滤膜、定量小管（1mL ）（3））配制：a. 各吸取10 μL单标原样品至定量小管中，用甲醇定容至1mL ，再过膜转移至进样小瓶中；b. 各吸取10 μL单标原样品至一定量小管中，用甲醇定容至1mL2.2 参数的搜集由相关文献查阅待测组分的质谱信息：代号名称母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能(eV)156.0 10 S12 磺胺嘧啶251.0185.1 15156.0 10S7 磺胺甲基嘧啶265.1172.0 10 S13 磺胺二甲异嘧啶279.0 124.1 20186.0 10156.0 10 S15 磺胺二甲异恶唑268.0113.0 102.3 方法建立的过程：2.3.1 质谱参数的确定打开数据采集软件（Data Acquitation Mass Hunter ，在线软件中正上方调出“HJJ.Method ”文件夹中的“OPTIMIZE.m ”方法）A 在窗口下面的Sample Run 中进行编辑(1) 样品信息（Sample ）Position:1F9 ；Injection Volume :5 μL ；(2) 数据文件信息（Data file ）Name ：HAEJYE00d.Path: D ：\MassHunter\Data\LSY\20150125pest-testB 母离子的确定：在Method Editor 中进行编辑(1) 在QQQ 选项中设置参数① scan type:MS2 Scan ；②扫描范围：100 ~ 400m/z ；(根据相关文献查的母离子，保证在扫描范围内) ③扫描时间：500 ms （保证Cycle/s ≥1）[目的是保证采集足够的点，在记录系统中形成离子流图]；④碰撞能：5eV(2) 运行：Apply ；startQualitive Analysis （根据查找的资料确定母离子）母离子：268 （5）运行完毕后，在DA 位置点击View Date 查看数据，进入Qualitive Analysis 离线软件界面。