生物化学与分子生物学实验教学中心

09年秋季学期
层析法的分类

气相层析（以气体为流动相的层析法） 液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学 领域里常用的方法） 1.吸附层析：薄层吸附层析、吸附柱层析 2.分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析 3.离子交换层析 4.凝胶层析：柱层析、薄膜层析
如何分离鉴定氨基酸混合液？
生物化学与分子生物学实验教学中心
氨基酸的薄层层析
(Thin layer chromatography of amino acids)
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验目的

掌握薄层层析法的一般原理。 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离 的物质（即氨基酸混合液）。
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
器材

层析板、尺子、铅笔


烧杯、玻棒、量筒
吹风机
毛细管、层析缸
药匙 烘箱
生物化学与分子生物学实验教学中心
09年秋季学期
操作步骤 — 薄层板的制备
1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素 钠8毫升，调成均匀的糊状。
2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。
移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来
鉴定被分离的物质。
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验材料

吸附剂：硅胶 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 氨基酸的异丙醇溶液
丙氨酸、精氨酸、甘氨酸

展开剂：（正丁醇：冰醋酸：水 = 60：20：20 ） 显色剂：茚三酮溶液） 分析样品：氨基酸混合液
09年秋季学期
Ala Arg Gly
Mix
生物化学与分子生物学实验教学中心
结果计算
斑点至原点距离
Rf = 溶剂前缘至原点距离
小心量出斑点中心至原点中心距离， 再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算 出它们的 Ｒｆ值。 根据Ｒｆ值，鉴定出混合样品中氨基 酸的种类，并绘出层析图谱。
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
5.亲和层析
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理
1.薄层吸附层析法
一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为 固定相（吸附剂）。当流动相（展开剂）在固定相上
流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，
不同氨基酸在展开剂中的溶解度（解吸附）不一样， 吸附在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速
3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。
4、活化 70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板
面温度下降至不烫手时取出。
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
操作步骤—
点样
1、位置：用铅笔距底边2cm水 平线上均匀确定4个点。每个样 品间相距约1cm。 2、取样：用毛细管分别吸取氨 基酸溶液，取样量为毛细管柱 高5cm。
3、点样：点样毛细管轻轻接触 2cm Ala Arg Gly Mix
薄层表面点样。加样后原点扩 散直径不超过2mm。
09年秋季学期
1cm
生物化学与分子生物学实验教学中心
轻触疾起
操作步骤—
展开、显色
将薄层板点样端浸入展 开-显色剂，展开-显色剂液 面应低于点样线。盖好层析 缸盖，上行展开。当展开剂 上行至离薄板顶端2cm时， 停止展开，取出薄板，用铅 笔标记出溶剂前沿线，用热 风吹干或在85℃下烘干，即 可显出各个样品斑点。
实验原理
2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨 基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，
与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合
生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理
3. 相对迁移率—Rf值（rate of flow）
层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶 液前沿的距离之比为Rf值。 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故
率也不同，因而可以彼此分开。
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
硅胶吸附薄层层析

吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶 硅胶：表达式为SiO2· XH2O。层析用硅胶是一种多孔性 物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－ Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键 而产生吸附.
数据处理
样品
Arg Gly Ala 混合液
斑点-原点
溶剂前缘-原点
Rf值
注意事项
1.切勿用手直接接触薄层板面。
2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二
滴。
3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太
多，易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
复习思考题

丙氨酸、精氨酸、甘氨酸的迁移快慢？
甘氨酸
丙氨酸
精氨酸
氨基酸的异丙醇溶液： 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 展开剂： （正丁醇：冰醋酸：水生物化学与分子生物学实验教学中心 = 60：20：20 ） 09年秋季学期
The scan of TLC plate (silica gel G) with 10 essential oils developed with mobile phase toluene(甲苯 ) - ethyl acetate(乙酸乙酯) (93:7 v/v), next sprayed with vanillin(香兰素) in H2SO4 and heated
生物化学与分子生物学实验教学中心
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
硅胶吸附薄层层析
特点：
① ② ③ 高。
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也 硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中 硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过
与含水量呈负性相关。
性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。
09年秋季学期
生物化学与分Leabharlann 生物学实验教学中心层析技术

概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如 溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）, 使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同 速度随流动相向前移动而达到分离的目的。 特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。 不仅可用于少量物质的分离纯化，也可用于大量物质 的分离纯化和制备。