细胞传代的方法
➢贴壁细胞传代 酶消化法：常用含0.25％的胰蛋白酶的消化液。 ➢半悬浮细胞传代 贴壁生长，但贴壁不牢（如Hela细胞），可用直接吹打 法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 ➢悬浮细胞传代 离心法传代：离心（1000rpm×10min）去上清，沉淀 物加新鲜培养液后吹打悬浮后传代。 直接传代：悬浮细胞自然沉降后吸去1/2以上培养液， 补充新鲜培养液后吹打悬浮后传代；或直接加入等量新 鲜培养液后吹打分散传代。
Drawback of the primary culture： 费时费力；细胞异质性；重复性差；容易污染
基本步骤
获取无菌组织并漂洗，剔除 多余血块和杂质，组织剪碎
蛋白酶消化或机械分离
（尼龙网或铜网过滤） 接种培养（培养瓶盖拧紧后松半圈）
原代细胞取材的基本要求：
• 注意组织类型、分化程度和年龄等，尽量选容易培养的组织 • 保持组织活性，不能立即处理和培养的要低温保存和运输 • 严格无菌 • 避免组织干燥 • 尽量剥离或漂洗掉不需要的组织细胞 • 做好记录，如组织来源和供体的一般情况
• 鼠胚组织：孕鼠颈椎脱臼处死，在75%酒精中浸泡5min， 腹部朝上，无菌手术取出胚胎，PBS漂洗。
组织细胞的分离
• 悬浮细胞的分离：血液等1000rpm离心10min，沉淀用无 钙镁离子的PBS洗涤2次、培养液洗涤1次后分瓶培养。也 可用密度梯度离心法分选所需的细胞。
• 实体组织的机械分离：适合于纤维成分少的软组织如脑、 脾和胚胎等以及间质少的肿瘤组织，充分剪碎后通过注射 器针头挤压或尼龙筛上研磨。
小鼠肝细胞的分离培养 ——组织块法
①将孕鼠或新生小鼠处死，置75%酒精泡2-3s，碘酒消毒腹部， 解剖取肝脏，置平皿中。 ②用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物。 ③将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次。 ④组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。 ⑤翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块， ⑥置37℃培养箱静置3-5h，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养 液中，继续培养。
第四章. 细胞培养的基本技术
第一节. 原代和传代细胞的培养
原代培养（primary culture） 传代培养（subculture）
一、原代培养（primary culture）
Why do primary culture? ✓ 没有现成的细胞系模型 ✓ 原代细胞比有些细胞系更能模拟体内细胞的特性 ✓ 特殊病理状态的标本 ✓ 有些细胞不增殖，如神经元、肌细胞、T细胞等
大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离培养
✓大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒5 min。 ✓剥离股骨和胫骨，置于75% 酒精的烧杯中，移入超净台。 ✓将胫骨、股骨置于培养皿中加入10 ml PBS，进一步剥离附着 组织，少量PBS冲洗，加入12 ml DMEM完全培养基。 ✓在培养基中剪断骨干两端，注射器吸取培养基插入一头断端将 骨髓从另一头冲出，反复吹打制成细胞悬液。 ✓离心管中加入10 ml Percoll分离液，将细胞悬液倾斜缓缓加入 （不能冲破Percoll分离液面），用8 ml 培养液冲洗培养皿，再 加入离心管。 ✓2500-3000 rpm离心30 min，先吸去上层红色培养基层，将吸 管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出移至另一离心管。 ✓加20 ml PBS反复吹打混匀，1800 rpm离心10 min，弃上清。 重复离心一次，弃上清。 ✓加入5 ml完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。
二、传代培养（subculture）
首次传代的注意点
• 细胞密度不高时不能急于传代 • 原代细胞多为异质性，胰酶消化时要掌握好消化时间，
最初几次的消化时间一般比已建系的细胞长些 • 轻轻吹打，不能有大量泡沫和听到明显吹打声 • 首次传代的接种密度高于常规传代 • 首次传代培养液pH偏低些，血清浓度略高些
①将孕鼠或新生小鼠处死，置75%酒精泡2-3s，碘酒消毒腹部， 解剖取肝脏，置平皿中。 ②用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物。 ③用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次， 转移至离心管中。 ④视组织块量加入5-10倍的0.25%胰酶液，37℃水浴中消化204ห้องสมุดไป่ตู้min，每隔5min振荡一次，使细胞分离。 ⑤待组织变得疏松，颜色略为发白时，加入3-5ml含血清的培养 液终止消化。 ⑥1000rpm离心10min，弃上清。 ⑦加入Hank’s液5ml重复离心一次，弃上清。 ⑧加入F12培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 ⑨调整细胞密度至5×105/ml左右接种培养。
• 实体组织的消化分离：组织剪碎后利用酶的生化作用或非 酶的化学作用破坏细胞间连接，吸管吹吸使组织充分松散。
消化分离细胞方法
胰蛋白酶Trypsin
• 水解细胞间质中的蛋白质使细胞分散，广泛用于传代 细胞的消化及细胞间质较少的软组织。
• 终浓度0.25%，无钙镁离子的PBS配制，PH7.6-8.0 • 37 C消化0.5h，或4 C消化过夜 胶原酶 Collagenase：通过消化ECM中的胶原蛋白而分散
A
C
D
肿瘤细胞的原代培养
✓肿瘤的特点：血管丰富，被纤维基质或结缔组织包绕 ✓取材：避免坏死组织，选取细胞集中和活力较好的部位 ✓通常采用机械分离并组织块培养法 ✓降低血清浓度（0.5%)，加胰岛素和转铁蛋白(10 μg/ml), 以减少成纤维细胞污染；还可采用机械刮除法纯化 ✓需用不同的促细胞生长因子促进其对环境的适应，也可采 用动物媒介培养
细胞，适于消化纤维性组织、上皮组织和癌组织， 终浓度0.1-0.3mg/ml
EDTA：通过与钙镁离子螯合破坏细胞间连接，对上皮组 织分散效果好。终浓度0.02%，常与胰酶合用
原代细胞的培养方法
✓组织块培养法 ✓消化培养法/单层细胞培养法 ✓悬浮细胞培养法 ✓器官培养
组织块培养法
消化培养法
小鼠肝细胞的分离培养
各类组织的取材技术
• 皮肤和粘膜：切取2-4cm2皮片，大多以培养上皮细胞为目 的，取材不要太厚并尽量去除皮下或粘膜下组织；如欲培 养成纤维细胞则反之。
• 血细胞：一般抽取外周静脉血，或从淋巴组织（脾、淋巴 结等）分离细胞，抽血时注意抗凝（肝素或柠檬酸盐）。
• 内脏和实体瘤：熟悉所需组织的类型，避免掺入不需要的 组织；肿瘤组织取细胞丰富的外层并避开坏死或破溃部分； 尽量去除血管和结缔组织。