猪伪狂犬病病毒主要功能蛋白基因序列分析
摘要：根据Genbank中已发表的猪伪狂犬病病毒（PRV）gE、TK基因的序列各设计了1对引物，对分离得到的PRV毒株的gE、gG、TK基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序，测序结果与预期的PRV gE、gG、TK基因片段相符。
遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRV毒株的gE、gG、TK氨基酸序列发生变化的位点与2012年国内分离到的PRV 流行株相同，从而推测该毒株为PRV变异毒株。
关键词：伪狂犬病毒；gE基因；TK基因；序列分析
猪伪狂犬（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Peudorabies virus，PRV）引起的以家畜和多种野生动物发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性传染病[1]。
该病在我国发生较为严重，是严重危害我国养猪业的疫病之一。
我国目前广泛应用的是自然缺失弱毒活疫苗Bartha-k61株，使猪伪狂犬病得到了很好的控制。
但是，2011年底至2012年该病在中国东北部分省份流行，甚至在许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了猪伪狂犬病疫情，给中国的养猪业造成了巨大的经济损失[2-6]。
伪狂犬病病毒(猪疱疹病毒1型)属于双股线性DNA病毒，大小约150kb，DNA基因组中G+C的含量高达73%，可编码100种蛋白质。
基因组由独特的长节段(UL)、独特的短节段(US)、内部倒转重复序列(IRs)和末端倒转重复序列(TRs)组成。
在病毒的结构蛋白中，gE糖蛋白是主要毒力因子之一，并作为标志基因用来区分疫苗免疫和野毒感染。
TK基因不仅是最主要的毒力基因，而且也是决定病毒持续感染的重要因素[7]。
一旦TK基因缺失，PＲV变异株对宿主的毒力将丧失或明显降低。
2013年至2014年上海市农业科学院畜牧兽医研究所繁殖障碍研究室从山西某免疫猪伪狂犬病（Bartha）疫苗的规模化猪场成功分离并鉴定出四株PRV，命名为SX1，SX2，SX3，SX4株，为明确该四株分离株是否属于PRV抗原变异毒株，本研究对PRV SX株的gE、gG、TK全基因进行克隆和测序，通过与国内外其他已公布PRV分离株的gE、gG、TK推导的氨基酸序列进行比对，构建核苷酸序列遗传进化树，以期为丰富PRV分子流行病学和开发科学有效的新型猪伪狂犬病疫苗提供重要科学依据。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 毒株、菌种和质粒PRV SX株由上海市农业科学院畜牧兽医研究所繁殖障碍课题组分离并保存；pMD-19T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.1.2主要试剂病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（DP315）、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；T4 DNA连接酶、TaKaRa LA Taq with GC Buffer均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2方法
1.2.1引物设计与合成参照GenBank中PRV gE、TK基因序列，利用Primer Primer 5.0软件，设计2对引物。
引物序列：上游引物gE-F:5’-atgcggccctttctgctgcg-3’，下游引物：gE-R:5’-ttaagcggggcgggacatca-3’。
上游引物gG-F:5’-atgaagtgggcaacgtggat-3’,下游引物：gG-R:5’-tcaggcggaggccacgtgg-3’，上游引物TK-F：5’-atgcgcatcctccggatcta-3’，下游引物：TK-R：5’-tcacacccccatctccgac-3’，分别用于扩增gE、gG、TK全基因。
1.2.2 病毒基因组的提取与扩增取200µL病毒悬液于1.5mL离心管中，反复冻融3次，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（DP315）说明书提取病毒DNA。
用所设计的特异性引物进行PCR扩增。
取10µL PCR产物，置于浓度为10g/L 的琼脂糖凝胶上电泳。
将PCR产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒切胶纯化回收后与pMD-19T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性重组质粒送测序。
1.2.3 目的基因的序列分析采用DNAStar生物软件对PRV所测定的gE、TK基因推导的氨基酸序列与GenBank中收录的其他国内外毒株的序列进行比对，并构建gE、TK基因核苷酸序列的遗传进化树。
2 结果与分析
2.1病毒gE、TK基因的PCR结果
以PRV SX株病毒基因组DNA为模板，用PCR的方法分别扩增出约1740bp，1500bp和963bp的基因片段，琼脂糖凝胶电泳图显示目的基因片段条带大小与预期结果符合（图１，图2，图3）。
PRV SX株gE、gG、TK基因的测序由上海
生工生物科技有限公司完成。
gE 、gG 、TK 基因去除起始密码子和终止密码子，全长分别为1734bp ，1494bp 和957bp ，分别编码578，498和319个氨基酸。
2.2 遗传进化树分析
从GenBank 中选取近几年国内外成功分离并已公布的的PRV 毒株，对
PRVSX 株的gE 、gG 、TK 基因构建遗传进化树，进行进化关系分析。
gE 、gG 、TK 基因遗传进化树分析 通过比对分析，gE 、gG 、TK 基因序
列和国内新分离得到的PRV 毒株具有很高的同源性，分别达到99%，98%，99%以上。
gE 基因的遗传进化树结果见图4，gG 基因的遗传进化树结果见图5，TK 基因的遗传进化树结果见图6。
由进化树结果可知，从所有参与分析的毒株来看，PRV SX 株与国内新分离得到的PRV 毒株亲缘关系很近。
泳道
1：样品1；泳道2：样品2,；泳道3：样品3，泳道4：样品4；泳道5：阳性对照，泳道6：阴性对照 图1 gE 基因PCR 电泳图
泳道1：样品1；泳道2：样品2,；泳道3：样品3，泳道4：样品4；泳道5：阳性对照，泳道6：阴性对照
图2 gG 基因PCR 电泳图 泳道1：样品1；泳道2：样品2,；泳道3：样品3，泳道4：样品4；泳道5：阳性对照，泳道6：阴性对照 图3 TK 基因PCR 电泳图
3 结论
2011年底至2012年在中国东北地区许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化
猪场出现了猪伪狂犬病疫情。
国内学者在2012年暴发猪伪狂犬病的疫情场中成功分离并鉴定出PRV 变异株[2-6]，为明确此次山西省该规模化猪场发生的猪伪狂犬病疫情是否为该类流行株引起，以及与各毒株之间的遗传进化关系，本研究运用PCR 方法对PRV SX 株的gE 、TK 基因进行了全基因扩增，与其他分离株的氨基酸序列进行同源性比对分析并进行核苷酸序列的遗传进化分析，明确了PRV SX 株gE 、gG 、TK 基因与其他国内外分离到的PRV 毒株具有很高的同源性。
综合上述结果可推测该规模化猪场发生的猪伪狂犬病疫情是由PRV 流行株引起。
本研究为PRV 的流行病学调查分析奠定了基础，也为开发科学、有效的新型猪伪狂犬病疫苗提供科学依据。
图5 gG 基因进化树分析
图4 gE 基因进化树分析
图6 TK 基因进化树分析
主要参考文献：
[1] 殷震, 刘景华. 动物病毒学[M]. 2版. 北京: 科学出版社,1997: 700-713
[2]安同庆，赵鸿远，彭金美，等．猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征[J]．中国预防兽医学报，2014，36（7）：506-509
[3] 陈红英，高晓云，郭小参，等．猪伪狂犬病病毒原阳株gE全基因的克隆与序列分析[J]．国外畜牧学：猪与禽，2014，3：58-60
[4] Yu X, Zhou Z, Hu D, et al. Pathogenic pseudorabies virus, China, 2012[J]. Emerging Infectious Diseases, 2014, 20(1):102-104
[5] Rui W, Bai C, Sun J, et al. Emergence of virulent pseudorabies virus infection in Northern China[J]. Journal of Veterinary Science, 2013, 14(3):363-365
[6] Wang C H, Yuan J, Qin H Y, et al. A novel gE-deleted pseudorabies virus (PRV) provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China[J]. Vaccine, 2014, 32(27):3379-3385
[7]Prieto J, Martín Hernández A M, Tabarés E. Loss of pseudorabies virus thymidine kinase activity due to a single base mutation and amino acid substitution[J]. Journal of General Virology, 1991, 72 (6):1435-1439.
彭老师，这是分析的结果，采用MEGA软件采用Bootstrap Test of Phylogeny --- Neighbor-joining方法制作的进化树，跟您截图的有些区别，可能是采用的软件不一致的缘故。
数值代表的是frequency, 一般数值越高可信度越强，低于50代表二者之间进化上比较远。