抗生素的提取
• 溶媒萃取法 • 离子交换法 • 直接沉淀法
抗生素的精制
药品生产符合GMP规定 • 脱色及去除热原质 • 结晶和重结晶
脱 色
• 色素是发酵过程中产生的代谢产物，与 菌种及发酵条件有关 • 活性炭脱色
热原质
• 在生产过程中由于被污染后由杂菌所产 生的一种内毒素，G-产生的热原反应高 于G+，是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体， 引起恶寒高热，甚至休克 • 活性炭吸附 • 超滤去除
抗生素生产的工艺过程
菌种 → → 孢子制备 → → 种子制备 → 发酵
发酵液预处理
提取及精制 → 成品包装
菌 种
• 来源于自然界，获得能产生抗生素的微生物， 经分离、选育和纯化后即称为菌种 • 菌种的保藏：冷冻干燥、超低温冷冻、砂土管、 液体石蜡、斜面低温保藏
孢子制备
• 将保藏的处于休眠状态的孢子，接种至固体斜 面培养基，在一定温度下培养5-7或7日以上 • 进一步用扁瓶在固体培养基上扩大培养
板框过滤 离心
湿晶体
成品
种子制备
目的使孢子发芽、繁殖以获得足够数 量的菌丝，并接种到发酵罐中 • 摇瓶或直接将孢子接入种子罐逐级放大 培养 • 种子培养定时取样作无菌试验，观察菌 丝形态，测定种子液中发酵单位和进行 生化分析 • 种子级数
培养基的配制
• • • • 碳源 氮源 无机盐类 前体
碳 源
• 供给菌种生命活动所需能量，构成菌体 细胞及代谢产物 • 参与抗生素的生物合成 • 常用碳源：淀粉、葡萄糖及油脂
过 滤
• 鼓式真空过滤器
提 炼
溶媒萃取法：将发酵滤液酸化至pH2，后 加相当于发酵滤液体积1/3的醋酸丁酯， 混合后以碟片式离心机分离；然后以1.31.9%NaHCO3在pH6.8-7.1条件下将青霉素 提取到缓冲液中，再调pH2，将青霉素从 缓冲液转入到醋酸丁酯溶液中
脱 色
在提取液中加活性炭150-300g/10亿单位， 进行脱 色、过滤
进一步精制
• • • • • 结晶与重结晶 共沸蒸馏法 柱层析法 中间盐转移法 分子筛
青霉素的生产工艺
S RCONH N O CH3 CH3 COOH
_ _ CH3 _ CH _ C NH CH- COOH NH 2 O CH3
• 菌种：产黄青霉素 （Pen chrysogenum） • 生产能力达到30000-60000µ/mL
菌种: 龟裂链霉菌 （Streptomyces Rimosus） 菌落灰白色，后期生皱褶，呈龟裂状。 菌丝呈树枝状分枝，白色，孢子灰白色、 柱形
生产工艺流程
砂土管孢子 一级种子 发酵
32±0.5ºC 30-32h 32ºC-31±0.5ºC- 32ºC 160h
斜面孢子 二级种子 提取
37ºC 4-5天 31±0.5ºC 24-26h
工艺流程
冷冻管
孢子培养 25°C,67d 种子培养 25°C,4045d 1:1.5VVM
斜面母瓶
孢子培养
大米孢子
一级种子罐 发酵罐
25°C,67d罐
冷至15 °C
发 酵 1:2VVM 22-26°C,6-7d 1:1-0.8VVM
提炼
培养基
• 碳源：利用多种碳源和乳糖、蔗糖、葡萄糖等。 普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液进行流 加 • 氮源：可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼 粉或麸质粉，并补加无机氮源 • 前体：为生物合成含有苄基基团的青霉素G， 在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺，加入 量不能大于0.1%，采用多次加入方式 • 无机盐：硫、磷、钙、镁、钾等盐类
氮 源
• • • • 构成菌体细胞物质和含氮代谢物 参与含氮抗生素合成 有机氮源 无机氮源
无机盐和微量元素 • 同其他微生物
前 体
• 菌体利用其构成抗生素分子中的一部分 而其本身没有显著改变的物质 • 一定条件下控制菌体合成抗生素的方向 并增加抗生素的产量
发 酵
• • • • • • • 目的是使微生物大量分泌抗生素 接种10% 通气 搅拌 控制罐温 消泡 控制pH 定时采样进行生化分析、镜检，测定菌体浓度、 残糖量、抗生素含量等
砂土管
• 黄沙：土 = 1：1（沙和土都经处理，水 洗至中性，烘干，研细，过筛） • 每管装一定量的砂土，塞好棉塞包好， 121℃高压蒸汽灭菌后再用160 ℃ 干热灭 121 160 菌2h • 每支砂土管加0.3mL孢子悬浮液，包好， 放入装有干燥剂的真空干燥剂内抽干612 h，轻轻敲打使其均匀。完后，放入装 有干燥剂的密闭瓶内，0-4℃贮藏
发酵工艺控制
• 温度控制：前期25-26°C，后期23 °C • pH控制：一般为6.4-6.6，加酸加碱及加 葡萄糖控制 • 通气：一般为1：0.8VVM • 搅拌：要求发酵液中溶解氧量不低于 30%。 • 泡沫与消沫：少量多次加入消沫剂，在 发酵前期不宜多用
发酵工艺控制
• 加糖控制：根据残糖量与发酵过程中的 pH来控制，也可根据排气中CO2与O2量 来控制 • 补氮：发酵液氨氮控制在0.01-0.05% • 加前体：残余苯乙酰胺浓度控制在0.050.08%
发酵液的过滤和预处理
• 分离菌丝、去除杂质 • 预处理：去除高价无机离子和蛋白质 • 过滤：去除固形物及菌体
发酵液的预处理
• 草酸及磷酸去除高价离子钙、镁，还能 促使蛋白质凝固 • 黄血盐有利于去除铁离子 • 硫酸锌有利于凝固蛋白质 • 等电点法、加热法、絮凝法去除蛋白
发酵液的过滤
• • • • 板框过滤机 鼓式真空过滤机 自动出渣离心机 倾析器
共沸蒸馏
将萃取液以0.5mol/LNaOH液萃取，调pH 至6.4-6.8，加3-4倍体积丁醇，在1626°C，5mmHgG下真空蒸馏，将水与丁 醇共沸物蒸出，并随时补加丁醇。当浓 缩到原来水浓缩液体积、蒸出馏分中含 水达2-4%时，停止蒸馏，青霉素钠盐结 晶析出，过滤，洗涤，干燥得成品。
土霉素生产
斜面
• 250 ml茄子瓶 • 麸皮4%，麦粉2%，琼脂2%
• 一级种子 400-500L夹套 • 二级种子
3（搅拌） 4m
发 酵
15%接种量 培养基： • 碳源：淀粉 经α-淀粉酶液化 • 氮源：黄豆饼粉，硫铵 • 无机盐：KH2PO4，NaCl ，CaCO3， CoCl2 • 生长因子：酵母粉，玉米浆
青霉素生产菌生长发育阶段
• • • • • • I期 分生孢子发芽 II期 菌丝繁殖 III期 形成脂肪粒，积累贮藏物 IV期 脂肪粒减少，形成中、小空泡 V期 形成大空泡，脂肪粒消失 VI期 细胞内看不到颗粒，个别细胞出现自溶
青霉素生产菌生长发育阶段
• I-IV期为菌丝生长期，产青霉素较少，菌 丝浓度增加很多 • III期适于作种子 • IV-V期青霉素分泌期，菌丝生长趋势减 弱，大量产生青霉素 • VI期菌丝自溶期
发酵液
(26000 r/ml)
酸化液+低单位套液
并加适量黄血盐，搅30′ 加黄血盐及硫酸锌
稀释到7500-8000 r/ml
稀释液
净 化 滤液（土霉素草酸）
净化液
板框过滤
滤渣（草酸钙、蛋白质、菌体、 铁络合物）
滤液
离子交换 122#
脱色液
氨水调pH4.1-4.7 搅50′
土霉素↓ + 草酸
气流干燥 80-90ºC
采用中间补料，延长抗生素分泌期， 是提高抗生素产量的重要方法。土毒素 生产过程采用补糖与补氨，以保证其在 分泌期有足够多而不过多的养料。 • 总糖 前期 0-80 h 6.5-8% 中期 80-120 h 5-6.5 % 后期120-140 h 4-5 % 末期 140 h后 4% 放罐残糖3%以下，放罐前24 h不补料
补氨同时为调pH，pH=6.0-6.3，放罐 前8 h停止通氨，整个过程通氨水总 量350-400升
预处理
土霉素能和发酵液中钙盐、镁 盐 ，某些有机胺、蛋白质形成不溶 性化合物，积聚在体内。 预处理目的为： 1）使部分土霉素溶液解出来 2）蛋白质（菌丝）沉淀 3）Fe3+沉淀
提取工艺
加草酸及盐酸酸化pH1.7