题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达李宏远 2014236053立题依据：随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。

1.选材：大肠杆菌大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。

而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。

2.基因标记技术基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。

荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。

荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。

3.绿色荧光蛋白从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。

分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。

其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。

绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。

【实验目的】研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。

【研究意义】研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。

通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。

根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。

GFP的应用特点检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。

实验题目包含的内容本实验的目的是通过BamH I和Not I两种限制性内切酶的消化把EGFP基因从pEGFP-N3质粒中克隆出来，或者用PCR方法把EGFP基因从pEGFP—N3质粒中扩增出来。

并定向插入到表达载体pET-28a质粒的多克隆位点(MCS)中，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG 的诱导下表达出带有N端His-Tag的融合蛋白。

表达了GFP的菌体在离心管中则会呈黄绿色，在紫外光激发下发射出特异的绿色荧光，从而证明了目的蛋白的表达是否成功。

另外在菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳图谱中如果出现了明显的诱导条带，则条带中蛋白浓度与诱导时间呈正相关。

【根据现有的知识和技能来设计进行实验】1.查询两个质粒特点的资料：•pEGFP-N3质粒编码野生型GFP的红移(荧光波长较大)变异体蛋白，具有更强的荧光(在485nm激发下比野生型强35倍)和在哺乳动物细胞中有较好的表达。

激发峰在488nm，发射峰在507nm。

•pET-28a质粒载体上面携带一个N-terminal His Tag／Thrombin／T7 tag结构以及一个可以选择的C-terminalHisTag。

克隆表达区域的编码框由T7RNA聚合酶转录。

2.根据查询的资料，确定两种途径可以到达目标第一种方法：用限制性内切酶方法，如果选定内切酶的方式去做实验，如何选择内切酶，选哪种内切酶即合用又经济。

根据两个质粒结构的特点，要在多种内切酶中进行选择，考虑pEGFP片段完整又考虑到被克隆的目标载体表达区域的编码框正确性。

使用Notl酶，Bamhl 酶，这是一对最合适的内切酶。

第二种方法：用PCR基因扩增方式达到目的。

如果用PCR方法去做实验，必需根据pEGFP的序列设计引物。

【实验原理】1.质粒重组：先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。

2.PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR 技术是Kary Mullis 在1985 年建立起来的在细胞体外合成DNA 的一种方法。

依DNA 半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA 模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA 片段，包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA 的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5'端限定的特异性片段形成指数式积累。

整个过程操作简单，可在短时间内在小管中获得大量的特意的DNA 拷贝，这一特点使PCR 技术很快被应用到了分子生物研究的广大领域[3]。

【参考文献】[1] 梁国栋. 最新分子生物学实验技术[ M] . 北京: 科学技术出版社, 2001, 174.[2] 贾艳华，李国勋，张杰荧光蛋白及其应用[3] 魏春红，李毅主编聚合酶链反应----PCR 现代分子生物学技术高等教育出版社，2006.7:45-46【研究方案】通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，根据观察是否可以看到显现绿色，判断GFP基因是否在大肠杆菌中成功表达。

【关键词】绿色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达【技术路线及实验方案】【实验材料及试剂】注：最初始的两个质粒pEGFP-N3质粒，pET—28a质粒。

1.实验材料克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21，质粒pET-28a 和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶Bam H1、Not Ⅰ。

2.实验试剂SIM-f140 SANYO Eppendof离心机电泳仪电子天平台式离心机控温磁力搅拌器调温电热套pH计冰箱台式冷冻恒温振荡器手提紫外灯生物洁净工作台琼脂糖凝胶电泳电泳装置电热恒温水温箱凝胶成像分析系统酒精灯培养皿移液枪枪头接种环酒精棉球灭菌枪头Parafilm膜离心管IceMaker【实验方法】•重组质粒的构建•DH-5α和BL-21感受态细胞的制备•感受态细胞的转化•碱法提质粒•酶切鉴定•琼脂糖凝胶电泳•PCR-聚合酶链式反应•Pet-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-21•重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达【具体实验步骤】1. 重组质粒的构建重组质粒pET-28a-GFP的构建流程2. DH-5α和BL-21感受态细胞的制备1)将0~4 ℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。

2)将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。

3)取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min离心5 min。

弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。

冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。

4)弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。

3. 感受态细胞的转化取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。

2) 加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。

3) 42 ℃水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。

4) 加入200 μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。

5) 取200 μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 ℃培养倒置12-16 h。

4.碱法提质粒1）感受态细胞经转化培养后，平皿内有但菌落长出。

2) 用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37 ℃, 180 r/min振荡培养过夜。

3) 取1.5 ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 ℃、11000 r/min 离心1分钟，吸弃上清。

4) 向离心管中加入150 μl用冰预冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重悬沉淀。

5) 加入200 μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。

6) 加入150 μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻混匀，冰上放置3~5分钟。

7) 用微量离心机于4 ℃、11000 r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。

8) 加等体积氯仿400 μl抽提，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。

9) 吸取上清液300 μl，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心5分钟，弃上清。

10) 用70%乙醇洗涤2次，再次4 ℃、11000 rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。

向已干燥的离心管内加20 μl超纯水溶解质粒DNA，加入2 μl 10 mg/ml RNA酶，37 ℃处理1小时后于-20 ℃贮存。

5. 酶切鉴定1)取提取的质粒8 μl于另一微量离心管中，加入2 μl Bam H I和Not I的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。

2) 离心，使溶液聚集在管底部3) 37 ℃，酶切反应。

6. 琼脂糖凝胶电泳1) 称取0.8 g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100 mL 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60 ℃左右。

2) 轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。

3) 将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。

4) 吸取10 μl的质粒与2 μl的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔。