quickness, sensitivity, non-destructiveness and Real-time detection. In this paper, we first introduce the principles and characteristics of confocal Raman microspectroscopy, resonance Raman spectroscopy, surface-enhanced Raman, Raman imaging, coherent anti-Stokes Raman, laser tweezers Raman and Raman-FISH respectively, and then focus on the application advantages of different Raman spectroscopy technologies employed to study the structure, chemical composition and metabolism of microbes. The proper use of these technologies in basic microbiology, microbial fermentation, diagnostic microbiology and other related aspects is very potential, especially in application. Key words: Raman spectroscopy Microbe Application
。Lee 等
［17］
通过表面增强共振拉曼散射检测了经 pH 诱导变性 的酵母异 -1-细胞色素 C 蛋白的光谱变化，他们发 现 当 pH<3 时， 酵 母 异 -1-细 胞 色 素 C 中 甲 硫 氨 酸 和组氨酸配体解离，引起分子结构的明显改变。在 中碱性条件下，氧化标志峰 1 375 cm-1，1 498 cm-1， 1 592 cm-1 和 1 640 cm-1 出 现， 表 明 在 低 自 旋 态 下 酵母异 -1-细胞色素 C 与血红素 Fe 结合。在 pH<3 时这些峰分别红移到 1 372 cm-1，1 489 cm-1，1 571 cm 和 1 602 cm ，表明在高自旋态下，酵母异 -1细胞色素 C 的第 80 位甲硫氨酸和第 18 位组氨酸配 体破裂。试验结果显示在低浓度的检测中，SERRS 比普通的共振拉曼光谱具有更高的灵敏度。
通过共焦显微
拉曼光谱反映即使在实验室条件下培养的菌落在单 细胞水平也存在光谱差异，显示明显的细胞异质性。
2
增强拉曼光谱术
由于拉曼散射效应的强度弱，在低浓度和微量
试样的检测与分析时遇到困难。增强拉曼光谱术能 有效克服这个弱点， 根据增强原理不同， 可分为两类： 共振拉曼光谱和表面增强拉曼光谱。
2.1
共振拉曼光谱技术（resonance raman spectroscopy，RRS）
・技术与方法・
BIOTECHNOLOGY
生物技术通报
BULLETIN
2012年第10期
拉曼光谱技术在微生物学中的应用
孙美娟1，2 刘军贤2 王雪1，2 陶站华1
2 （ 广西科学院生物物理实验室，南宁 530007 ； 广西师范大学物理科学与技术学院，桂林 541004） 1
摘
要： 拉曼光谱具有快速、 灵敏、 无损、 实时监测等显著特点， 在微生物学领域得到广泛应用。分别介绍共焦显微拉曼光谱、
［16］ 14 15
够从分子水平直观显示细胞内物质的分布，还能够 可视化细胞周期内细胞器的物质变化及代谢活动。 由于逐点扫描存在激发光功率高和数据采集 时间长等问题，人们发明了拉曼线成像用以克服点 成像的上述不足，在线成像中激光束聚焦于细胞上 一直线上的各个像素，将该直线的拉曼散射成像于 光谱仪的入射狭缝，直到入射于 CCD 探测器，可 同时测定一直线上许多点的光谱［9］ 。与点成像相 比，线成像测量时间明显缩短，在保证成像像素点 n 不变的情况下，试验持续时间可缩短至点成像的 1/ n ，线成像技术在生物学的研究及应用已有相关 综述［19，20］ 。
拉曼光谱丰富得多的光谱信息，适用于生物大分子 试样检测［9］ 。许多生物分子的电子吸收区位于紫 外，利用紫外共振拉曼光谱技术在蛋白质、核酸和 。深紫外 丝状病毒粒子的研究已取得显著成果［10-12］ 244 nm 可选择性增强芳香族氨基酸与核酸的信号， Neugebauer 等［13］用深紫外共振拉曼研究短小芽孢杆 菌的生长过程以及对常见抗生素丙环沙星的抗药性。 当采用 244 nm 激发光时，发现细菌在经历迟滞期、 对数期、稳定期的生长过程中，表征核酸的 1 480 cm-1 峰蓝移且强度略有降低，表征蛋白质的 1 607 cm-1 峰显著增强，同时说明深紫外共振拉曼光谱适 合于 DNA、蛋白质变化的检测。他们还比较了加入 不同剂量的环丙沙星（0.9 μg/mL，5.0 μg/mL）与对 照细胞的拉曼光谱发现，1 480 cm-1 和 1 620 cm-1 峰 附近区域发生变化，且差异明显，结合聚类分析和 主成分分析能够较好地区分经过不同剂量抗生素处 理的细胞，此方法可用于细菌的抗药性的研究。由 于共振拉曼光谱使用的紫外波长激光能量较高，其 热效应、光化学作用可能损伤试样，可以通过减少 积分时间和降低激光强度等相应措施减小对试样的 影响。
收稿日期 : 2012-02-23 基金项目 : 国家自然科学基金项目（31060128）, 广西科学院基本科研业务费资助项目（11YJ24WL01）, 广西师大博士科研启动基金 作者简介 : 孙美娟 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 拉曼光谱在生物中的应用 ; E-mail: meijuansun87@ 通讯作者 : 陶站华 , 男 , 副研究员 , 研究方向 : 生物光谱学 ; E-mail: taozhanhua@
Application of Raman Spectroscopy in the Microbiology
（ Lab of Biophysics，Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530007 ； College of Physics and Technology， Guangxi Normal University，Guilin 541004）
强度和线宽可提供分子振动、转动方面的信息，据 此可以反映分子中不同的化学键和官能团［2］ 。拉曼 光谱是分析分子结构和含量的有用工具［3］ ，现已越 来越多地应用于微生物的细胞结构、化学组成以及 代谢过程的研究［4-6］ 。与其他微生物检测技术相比， 拉曼光谱具有以下优势： 不触及试样， 无需样品制备， 具有非入侵性 ； 可对微生物的生长过程进行原位实 时研究 ； 检测迅速，灵敏度高，重复性好。 早期的拉曼光谱仪以汞弧灯为光源，样品产生 的拉曼散射谱线极其微弱，因此应用受到限制。直 至 20 世纪 60 年代激光光源的问世，微弱信号检测 技术的提高和计算机的应用克服了早期拉曼光谱技 术的弱点，使拉曼光谱作为一种鉴定物质结构的分
1 2
Sun Meijuan1，2
Liu Junxian2
Wang Xue1，2
Tao Zhanhua1
Abstract:
Raman spectroscopy has been applied extensively in the field of microbiology in recent years due to its characteristics of
1
共焦显微拉曼光谱技术（confocal raman microspectroscopy，CRM）
共焦显微拉曼光谱技术是将共焦光学显微技术
与拉曼光谱结合起来的一种应用技术，共焦显微拉 曼系统利用显微物镜将激光束聚焦到样品上，减少 了周围物质的干扰，可精确获取局部区域的拉曼光 谱信息，并且还可以通过改变聚焦深度的方法，观 测不同深度层面的拉曼信号。相比于传统的拉曼光 谱技术，共焦显微拉曼光谱的横向及轴向分辨率都 极大提高，可反映单个细胞所含化学成分的多维信 息。 Christian 等
微生物学是研究微生物在一定条件下的形态结 构、生理生化、以及微生物的进化、分类、生态等 规律及其应用的一门学科［1］ 。新技术和方法的引用 对于微生物学的发展至关重要，荧光标记技术、细 胞膜电生理技术以及高分辨率显微镜使我们对微生 物生命活动的直接探索成为可能，但各种抗体、染 色技术不仅价格昂贵而且会对生理状态下的微生物 细胞造成不同程度的影响或损伤。除此以外，大部 分技术还存在着试验操作复杂，耗时长等诸多弊端。 拉曼光谱的应用和发展，为微生物学研究提供了一 种新的方法。 拉曼光谱是一种产生于分子或者晶格振动能级 的光子的非弹性散射光谱，拉曼光谱特征峰位置、
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2012年第10期
析测试手段而被广泛应用。随后共焦显微拉曼、增 强拉曼光谱技术、拉曼成像等一系列新技术的出现， 为拉曼光谱技术的应用提供了广阔的前景。本文是 结合拉曼光谱技术的发展，分析了不同拉曼光谱技 术在微生物学研究领域中的应用优势。
［8］ -1 -1 -1 -1 -1rface - enhanced raman spectroscopy，SERS）
在金、银等贵重金属胶粒或粗糙金属表面作用
下，材料的拉曼横截面可以增大 107 倍，这种效应称 。表面增强拉曼光谱已成为 为表面增强拉曼效应［9］ 拉曼光谱研究中一个活跃的领域，可以获得常规拉 曼光谱所不易得到的结构信息。金属表面与细胞表 面相互作用的强度取决于细胞壁的生化结构，Sayin 等［14］ 采用 SERS 光谱识别酵母细胞壁的生化结构， 发现 -SH 和 -NH2 的含量在某些酵母细胞壁中可能 会更高，可用于遗传特性相差较小的酵母菌种的鉴 定。Liu 等［15］ 将 SERS 用 于 探 索 细 菌 细 胞 壁 的 精 细结构，可快速区分革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性 细菌及分支杆菌等不同细菌的细胞壁。他们还比较 了结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的拉曼信息，发 现分支杆菌属细菌细胞壁中存在分枝菌酸以及其他 特有物质。尽管表面增强拉曼目前仍存在要求试样 与金属颗粒相接触以及信号稳定性较差等应用限制，