二 鱼类mtDNA的提取方法
（1）直接从鱼类组织提取线粒体DNA 从肌肉、肝脏等组织中提取线粒体DNA 本实验使 用常规的碱变性法，将STE液稍加改进作为溶液改 进的STE液为：10 mmol NaC1，15 mmol TrisHC1(pH8.0)，45 mmol EDTA(pH8.0)，0.25 mol 蔗糖。把提取的线粒体DNA放人一20℃保存备用 。该方法获得的是鱼类的整个mtDNA分子。 选用的组织不同对应用范围的影响 一般肝细胞、胃 壁细胞、肾脏细胞中的线粒体数目较多，直接提取 mtDNA获得纯度和得率可观的mtDNA用于研究要 选取这些组织，必须杀死鱼才能得到，研究存在数 量多的鱼类可以采用该法。
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（2）先提取基因组DNA再用相应引物 PCR 扩增所需mtDNA某一区域序列 片段。
从肌肉、肝脏等组织中提取基因组 DNA，PCR扩增出mtDNA 区段根据 动物基因组DNA提取的一般方法，将 DNA提取缓冲液中各个成分含量进行 改进，PCR引物为鲤科鱼类线粒体 DNA细胞色素b通用引物。
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三 鱼类mtDNA研究的方法
1 限制性片段长度多态 • mtDNA由于大小、母系遗传方式、易
于提纯和进化上的特点等，成为 RFLP的最佳靶序列。但mtDNA进化 速率较快，不适合于科以上种间的比 较研究。目前该法应用较广泛，主要 方法有以下几种。
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标准RFLP 其研究步骤为：mtDNA样品一RE
mtDNA某一序列的引物作PCR，RE消化，溴化乙 锭染色，电泳检测。这一技术可直接酶切小于 500—2 000 bp的短小片段。
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• 2 测序法 直接测定mtDNA的全序列或特定片
段的序列。这种方法可获得大量直接 可靠的数据，但受技术条件和经费限 制，难以适应大群体、大样本的分析 。目前，结合PCR技术，可扩增特定 基因片段作测序分析，在一定程度上 扩展了测序法的应用范围。
• 4 进化速度快 鱼类mtDNA的突
变率高于核中DNA，为基因组DNA的 5一10倍，并且缺乏有效的DNA损伤 修复机制，修复效率低。
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• 5 解码体系简单 鱼类mtDNA的解
码由一个很小的tRNA体系完成，而不像在 核基因组摆动假说中所要求的需要在32个 tRNA反密码子上的摆动。
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mtDNA的研究方法存在局限性
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• PCR-RFLP法方便、快捷，对样品数量 和质量的要求低，费用和时间消耗少，但 终究只是对DNA序列的间接反映：而测序 法虽可获得大量的较为可靠的数据，但由 于技术限制和费用巨大，难以用于大群体 和大样本的遗传和进化研究。而且，在实 际研究中，由于统计学的缘故，基于DNA 水平计算的群体基因突变率往往高于真实 的情况。因而在进行鱼类分子群体遗传研 究时，应将遗传结构的分析结果与生物的 形态结构、生理特征和生态环境等因素综 合考虑，从更多的方面寻找更多的证据， 从而得出一个更加客观、系统而深入的认 识。
• 7 同质性与异质性 一般情况下，在一种生物机
体内仅存在一种类型的mtDNA分子，但现在大量发现一些个 体存在多种类型的mtDNA分子，这种特性被称mtDNA分子 的异质性。
• 8 多态性mtDNA中存在多态现象 多
态性集中在D环，其他区域则高度保守一。
• 9 母系遗传 鳗鱼线粒体为双亲遗传
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四 鱼类mtDNA研究的应用前景
• 1 保护濒危鱼种的遗传多样性 。保护生物学的中心议题是保护
生物的遗传多样性。mtDNA多态 分析可用来检测濒危物种的多样 性程度，是对物种是否濒危及其 可能的演变趋势的一种有效评估 方式，在鱼类濒危物种的保护和 恢复方面将发挥巨大的作用。
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• 2 由于mtDNA母系遗传的特 性，利用其母系遗传规律研究 单性鱼类的来源，使得鱼类 mtDNA多态分析在杂交带遗 传渐渗研究中具有巨大潜力， 并在进行杂种分析、揭示杂种 来源方面发挥巨大作用。
• 6 遗传的相对独立性ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱmtDNA能
以自身为模板进行复制，能转录生成信使 RNA(mRNA)、转运RNA(tNA)和核糖体 RNA(rRNA)，也能编码合成一些维持自身 结构和功能所必需的蛋白质，具有很大的 独立性。同时，线粒体的遗传行为受到核 基因的调控，这种调控主要是通过向线粒 体输入核DNA编码蛋白质和一些小的RNA ，特别是tRNA来实现的 。
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• 2 编码效率高 同核DNA相比
，mtDNA上的基因排列极其紧凑，且 无内含子，编码效率较高。此外，部 分mtDNA的密码子不同于基因组DNA ，且缺少终止密码子，仅以U或UA结 尾。
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• 3 拷贝数多 鱼类每个细胞中有
1000—10000个线粒体DNA拷贝，容 易从组织中分离纯化。
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阅读文献
鱼类线粒体DNA研究新进展(2019) 鱼类线粒体DNA及其在分子群体遗传研究中的
应用（2019） 鱼类线粒体DNA及其研究进展（2019） 鱼类线粒体DNA 的遗传与进化（2000） 鱼类mtDNA及其非编码区的研究现状（2009） 一种改进的鱼类线粒体DNA的快速
制备方法（2019） 两种获取鱼类线粒体DNA的方法比较（2000）
消化一电泳一结果检测。该法适合于分析样品中靶 序列含量相对较高的样品，如mtDNA和PCR扩增 产物，还可进行位点比较和片段长度比较。
探针法 又称杂交法。将基因组DNA酶切，用
mtDNA探针进行South杂交来识别DNA上的 mtDNA谱带，通过自显影检测印迹。
PCR—RFLP法 从细胞总DNA中，用扩增
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线 粒 体 DNA
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特点 提取方法 研究方法及其局限性 应用前景
一 鱼类mtDNA的特点
• 1 分子较小且存在长度多 态性 鱼类mtDNA分子大小范围一
般在15—20 kb之间，约占总DNA的1 ％。鱼类mtDNA的分子大小在种间存 在差异，但这种长度差异并非源于基 因数目，主要由于串联重复序列的存 在。