摘要越来越多的蛋白质多肽类药物被应用于人类疾病的治疗，与其它合成化学药物相比，它们有易引起机体的免疫反应，体内半衰期短，在体内易水解、变性等缺点。

化学修饰作为一种新兴技术，能改善上述不良特性。

本文主要优化合成了一种PEG修饰剂——mPEG．NHs，采用牛血清白蛋白BsA和溶菌酶作为模式蛋白对其修饰条件进行了优化，并用层析法分离修饰后蛋白质。

mPEG．NHS的合成主要通过两个反应得到，第一步是mPEG同丁二酸酐之间的酯化反应，得到mPEG—SA，第二步是mPEG—SA同NHS(N．羟基硫代琥珀酰亚胺)反应，在脱水剂DCCI(N．N’一二己基碳二亚胺)的催化下得到mPEG．NHS。

通过优化反应条件使得mPEG的转化率和mPEG．NHs的纯度都得到提高。

优化后反应条件分别为：n1酯化反应采用毗啶为催化剂，酸醇比为10：I，反应时间3 h；f2)脱水反应时间25h，温度400C反应物摩尔比mPEG．sA：NHS为1：2．5。

优化后的两步反应的转化率分别为60．1％和56．O％。

mPEG—NHS修饰蛋白质在不同的反应条件下得到不同修饰率的蛋白质，优化反应条件后能得到更高氨基修饰率的修饰产物。

最佳修饰反应条件为：反应时间10min，蛋白质和修饰剂质量比为1：5，采用pH=9．O的硼砂缓冲液，在优化条件下可得到修饰率为47．5％的产物。

由于修饰反应得到的蛋白质溶液中含有连接有修饰剂的蛋白质和未连接修饰剂的蛋白质，可通过层析的方法将它们分离开。

溶菌酶修饰产物采用seDhadex G．75凝胶层析和Deae．sepharose CL-6B阳离子交换层析相结合的方法：BsA 修饰产物采用sephadex G．100和Q．SeDharose阴离子交换层析相结合的方法。

用sDs．PAGE电泳检测分离产物，证明未修饰的蛋白质同被修饰的蛋白质被分离开来。

关键词：PEG修饰化学修饰合成优化分离层析随着生物工程技术的迅速发展，生物技术活性物质不断面世，已有不少生物技术药物应用于I}缶床，国内外已批准上市的约40多种，目前正在研究的则成倍增加，在这些品种中，大量的均为多肽与蛋白质类药物“。

蛋白质、多肽类药物(如肿瘤坏死因子、白介素、胰岛素等)以其疗效好、副作用低等突出优点受到了广大医务工作者及患者的青睐。

但与其它合成化学药物相比，它们也有易引起机体的免疫反应，体内半衰期短，在体内易水解、变性，不易储藏等缺点。

另外，由于多数蛋白质和多肽类药物具有较低的分配系数和很小的扩散性能，使其不易被亲脂性膜所摄取，很难通过生物屏障，因此尽管DNA重组技术已使蛋白质、多肽药物可以大量生产，但由于以上因素从而大大限制了它们在临床上的应用。

为此，研究和开发稳定，半衰期长，生物相容性好并且容易吸收的蛋白质、多肽药物体系一直是科学工作者们试图解决的一个迫切课题。

1.聚乙二醇的性质及制备方法1．1聚乙二醇的性质聚乙二醇(polyethyleneglycol，简称PEG)是一种能同时溶于水和有机物的具有油水二亲性的高聚物。

聚乙二醇同蛋白质相连可改变蛋白质生物化学特性，包括分子大小，疏水性及电荷等，增加蛋白水溶性和稳定性：PEG与药物相连，能够增大药物的相对分子质量，减少肾消除，延长药物的半衰期，增大药物的水溶性，并且PEG链包裹在药物表面，能够遮蔽药物的抗原决定簇，降低药物的免疫原性。

PEG化(pegylati。

n)技术在药学、人工移植和其它应用方面都有很大用途。

1977年Abuchowski等首先应用聚乙二醇修饰BsA01。

在这以后的二三十年里，PEG修饰技术发展迅速，而且很快得到了广泛应用。

目前较为常见的被PEG 连接的分子有蛋白质和多肽，特别是一些疏水性的分子。

除此之外，PEG与紫杉醇、喜树碱、阿霉素、阿糖胞苷、鬼臼毒素等小分子药物的连接也显示出较好的应用前景“3。

高分子量PEG已被FDA批准用于人体。

迄今已有7个药物通过FDA批准进入市场“1。

修饰蛋白质等高分子常用的PEG相对分子质量为200～40000，分子量小于1000呈无色透明液体，大于1000在室温下呈白色或米色糊状或固体，微有异臭。

PEG易溶于水和多数极性溶剂，不溶于脂肪烃类、苯和矿物油等非极性溶剂。

PEG具有很强的吸湿性，随着相对分子质量的增大吸湿性迅速下降。

它还具有微弱的表面活性，随着其水溶液浓度的增加，表面张力逐渐减小。

相对分子质量较低的PEG水溶液黏度不高，随相对分子质量的增高而上升。

PEG的大鼠口服半致死量LD50分别为：PEG200为28．9ml／kg，PEG400为30．2 ml／kg，PEG4000为599／kg”。

1．2聚乙二醇的制各方法聚乙二醇(p01yethylene 91ycol，PEG)是用环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合得到的相对分子质量较低的水溶性聚醚，反应通式如下：+H：o—t Ho髑脚1陆H^＼／。

哭7心+茹●啪两脚，陆H氧乙烷开环聚合是离子型聚合反应，用酸或碱作催化剂(常用碱或配位阳离子作催化剂)，用水、乙二醇、乙醇或低相对分子质量聚乙二醇作引发剂，后者适合制备相对分子质量大于l，ooO的聚合物。

聚合方法可采用液相或气相聚合，用脂肪烃和芳烃作液相聚合溶剂，用氢氧化物作催化剂。

此反应在150～180。

C、0．3～0．4MPa下进行，反应器中使用稀有气体填充，以防环氧乙烷和空气形成爆炸性化合物。

当反应达到预期相对分子质量时应降低压力，中和催化剂，用离子交换树脂除去无机物，冷却过滤即得成品。

为避免在修饰过程中发生交联和团聚，常采用mPEG作为修饰剂的合成原料，其结构式为cH，0一(一cH。

一cH。

O)一H。

不同的聚合工艺和不同来源的mPEG的分散性不同，ⅢPEG的分散性高，修饰物的均一性难以保证。

另外，由于聚合过程中少量水的存在，111PEG 产品中有1～15的PEG二醇(0H—PEG—PEG_OH)杂质。

其含量取决于mPEG 的分子量，分子量越小，二醇的含量越低。

二醇在mPEG的活化过程中会产生交联或团聚。

若IIlPEG产品中存在二醇，凝胶过滤色谱图谱上就会出现一个位于主峰前的小峰，分子量恰好是mPEG的2倍；通过峰面积可确定相应的二醇含量”。

1．3聚乙二醇修饰对蛋白质等高分子的影响大多数蛋白质等高分子经PEG修饰后，其特性在一定程度上发生改变，许多不足之处得到改善。

l、免疫原性与抗原性消除或降低消除或降低蛋白质等高分子的抗原性效果明显。

PEG为一种亲水不带电荷的线性大分子当它与蛋白质的非必需基团共价结合时，可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，避免抗体的产生或者阻止抗原与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。

例如天门冬酰胺酶用PEG修饰后可消除抗原性”“…。

2、热稳定性提高这是由于PEG共价连接蛋白质等高分子后，其天然构象产生一定的刚性，不易伸展失活，减少了分子内部基团的热振动，从而增加了热稳定性。

热稳定性与PEG和蛋白质等高分子之问的交联点数目有关，单点交联并不明显，交联点增多稳定性提高。

热稳定性提高的另外一个原因是PEG本身增加了蛋白质等高分子的表面亲水性，使其在水溶液中形成新的氢键和盐桥。

3、抗各类失活因子能力提高PEG修饰后的蛋白质等高分子抗蛋白水解酶水解、抗抑制剂、抗酸碱和有机溶剂等变性失活能力提高。

原因是PEG所产生的空间屏蔽阻挡了失活因子的进攻。

此外，蛋白质等高分子中对蛋白水解酶等失活因子敏感基团被修饰，使其能力提高。

过氧化氢酶经PEG修饰后，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解能力明显提高。

4、体内半衰期延长许多蛋白质等高分子经PEG修饰后，抗蛋白水解酶、抗抑制剂等失活因子的能力和热稳定性提高，其体内半衰期比天然蛋白质等高分子长，对提高蛋白质等高分子的药用疗效极具意义…。

例如天门冬酰胺酶经PEG修饰后，体内半衰期可延长13倍。

5、溶解性增加药用PEG易溶于水和多数极性溶剂，不溶于脂肪烃类、苯和矿物油等非极性溶剂。

随相对分子质量升高，其在极性溶剂中的溶解度逐渐下降。

6、对组织分布能力的改变一些蛋白质等高分子经PEG修饰后可改变组织的分布能力，能在血液中被靶器官选择性吸收。

7、毒性减少PEG可使大多数蛋白质等高分子毒性减少，且本身无毒性(相对分子质量>1，000)，相对分子质量为4，000的PEG可按每千克体重169的剂量，以10％的溶液安全地注射人鼠、兔、猴等动物体内，不伤害蛋白质和细胞。

8、最适pH改变有些酶经PEG修饰后，最适pH值改变，这在生理和临床应用上以及工业生产中更好地发挥酶的催化作用方面极具意义””。

9、酶学性质的改变绝大多数酶经PEG修饰后，最大反应速度无变化，但米氏常数会增大。

用PEG还可能改变底物的专一性，如脂肪酶经PEG修饰后，就可溶于有机溶剂并能催化酯合成和酯交换等有机相反应，这将扩大其在科研和生产中的应用范围。

这种方法还可用于立体专一性的有机合成中。

10、动力学性质、等电点、电泳行为等改变在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，PEG修饰蛋白质等高分子的泳动速度明显减慢，且比按分子增长推算出来的速度还慢，推测与线状PEG分子间的相互缠结有关。

Lys的e—NH2带正电，PEG修饰后，蛋白质等高分子中的正电荷减少，故等电点降低。

2.聚乙二醇修饰技术的发展过程2.1新型聚乙二醇化技术的发展1977年Abuchowski等首先应用聚乙二醇修饰BSA““。

在这以后的二三十年里，PEG修饰技术发展迅速，而且很快得到了广泛应用。

第一代的PEG的修饰技术如图1．1所示，第一代PEG修饰常用的修饰剂有：单甲氧基聚乙二醇碳酸琥珀酰亚胺酯(mPEG—Sc)等，通过酯键或三嗦环将PEG与蛋白质分子偶联，这种非特异性的不稳定连接方式使得一个蛋白质分子经常连接上数个PEG分子。

如mPEG—ss偶联到Lys残基侧链的e～氨基上，由于蛋白质分子表面一般存在多个e一氨基，加之每个e一氨基的反应活性不同，因此，修饰产物往往是不同修饰程度及不同修饰位点的产物混合物，使用时需要将这些混合物分离开。

因此，第一代PEG修饰的蛋白类药物的通常表现出不稳定性、较大的毒性和免疫原性，生物活性、药代动力学的性质与原型药物没有本质的改变。

传统方法得到的PEG衍生物已经远远不能满足需求，新一代的PEG 衍生物以高分子量，特异性好，纯度高，功能多等优点取代了传统PEG衍生物的应用。

表1是新一代PEG衍生物同传统PEG衍生物的对比：表l_l新一代PEG衍生物同传统嘲生物性质上的区别Traditional PEG derivatives New generation PEG deriVatiVesHigh molecular weight (1—60Low molecular weight(<12 kDa) kDa)High percentage of dyad Low percentage of dyad sy啪etrysymmetry(10一15％) (<2％)Non—specific modification Specific modificationEach drug molecule is modified Each drug m01ecule is modified by several PEGs molecules：The by sin91e PEGs molecule：The activity activity of the drug is 10w of the drug is high．Instable in the physical Stable in the physical enviromnent envirOmentNew types of PEGderivatives．such as multi—arm PEGs：heterobifunctional PEGs2.2特异性PEG修饰蛋白质或肽类分子上的反应性官能团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>a一氨基>e～氨基>羧基>羟基。