1.105-107个细胞0.5ml 胰酶消化后，转入
2.0ml离心管，加冰冷的PBS至1.5ml，1600rpm
离心5min，弃上清，收集细胞。

2.细胞重悬于1ml冰冷的PBS，转入1.5ml离心管。

1600rpm离心5min，漂洗2次，离
心收集。

3.加入0.5ml含100ug/ml蛋白酶K和20ug/ml RNase A的DNA提取缓冲液（蛋白酶K和
RNase A用前加），混匀，50℃水浴3h或37℃过夜，期间不时旋转混匀。

裂解液配方：
Tris-cl 10mM
EDTA 0.1M DNA提取缓冲液1.5ml
SDS 0.5%
蛋白酶K母液（20mg/ml）7.5ul
RNase A母液（10mg/ml） 3 ul
4.冷却到室温后加等体积的（酚，氯仿，异戊醇25:24:1），缓慢颠倒混匀5-10min。

5.6600r/min离心15min，取上清。

6.用等体积的（氯仿，异戊醇24:1）抽提一次，取上清。

若蛋白多可重复抽提1-2次。

7.加入0.1倍体积的3mol/L 乙酸钠（pH 5.2）与2倍体积-20℃预冷的无水乙醇。

-20℃放
置20min-1h。

8.12000r/min，室温离心20min，弃上清。

9.用1ml 70%的乙醇洗沉淀2次（12000rpm离心2-5min），室温下干燥5-15min。

（不做其
它实验此步可省）。

10.溶于50 ul TE 中。

11.用1.2%的琼脂糖凝胶（0.3g琼脂糖+25ml TAE配制）检测DNA质量。

一般样品上样量
5 ul + 1 ul loading buffer；Marker上样量5ul。

注意：
1.枪头剪掉一截，防止移液时DNA断裂。

2.所配试剂pH要准确，酚的pH值必须接近8.0.以防离心后DNA滞留于水酚双相的交界
面（主要为蛋白质）上。

3.测定DNA样品在260nm和280nm处的光吸收，A260/A280之比应大于1.75，低于此
值表明制备物中存留有显著的蛋白质。

4.对于细胞裂解液中加入较高浓度的胰RNase A（20ug/ml），可省去传统方法中DNA抽
提后再加RNase A处理的步骤。

5.DNA抽提液中的EDTA浓度宜为0.1M，可有效抑制DNA酶且易与酚分层。

【原理】
将分散好的真核生物组织、细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质。

破坏细胞膜、核膜，SDS可使组织蛋白与DNA分子分离，EDTA能抑制细胞中DNase的活性，使DNA分子完整地以可溶形式存在于溶液中，再用酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质，氯仿可除去DNA溶液中微量酚的污染，异戊醇还可减少蛋白质变性操作过程中产生气泡，得到的DNA溶液经乙醇沉淀进一步纯化，为获得高纯度DNA，操作中常加入RNase除去RNA，此法可获得100-200bp的DNA片段，适用于构建真核基因组文库，southern blot分析。