多酚氧化酶的研究
简介
多酚氧化酶(polyphenol oxidase， 简称PPO）是一类广泛存在于植 物体内的含铜金属酶类.由于其与 果蔬加工、品质等密切相关,人们 很早就开始对它进行深入细致的 研究.
• 铜是酶的活性中心，从蛋白质中除 去一部分或全部铜，将引起酶活性 下降或完全失活，若添加铜的话， 酶活又能恢复。不同果蔬中的PPO铜 辅基的数量会有所不同，如蘑菇中 PPO含4个铜原子，而扁豆的PPO含1 个铜原子。
琼酯糖凝胶
已装柱好的苯基琼脂糖 PenlysepharoseCL4B柱,用高盐缓冲 液A预平衡, 酶液借助梯级蠕动泵加 在柱上,洗脱液以一定流速,从高盐缓 冲液A减弱至低盐缓冲液B,最后以 50%的乙二醇进行洗脱 。由紫外监 控器(280nm)监控，调节分级收集器 流速收集。
酶活性测定 测定波长视底物而定,测定 温度为25℃,反应液由pH4的柠檬 磷酸缓冲液、测定底物和酶液组 成,一个酶活力单位为测定条件下, 每分钟引起光密度改变0.001所需 的酶量。
葡聚糖凝胶
文献报道植物组织中PPO分子量一般 介于40-70K之间，根据葡聚糖凝胶分离大 分子的原理，葡聚糖凝胶分离PPO与杂蛋白。 不同型号凝胶的分离范围是根据球形蛋白 理论模型确定的，而实际分离蛋白的结构 与理论模型常有较大差异，因此在纯化PPO 时，采用不同型号的葡聚糖凝胶进 行分离效果的比较。
包括Sepharose和Bio-gel A等。 Sepharose与2,3二溴丙醇反应，形Sepharose CL型凝胶（CL-2B ~4B），分离特性基本没变，
琼脂糖是从琼提高，可以在更
广泛的pH范围内应用。
琼脂糖凝胶稳定性要超过一般的葡聚糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样 品的吸附作用很小。琼脂糖凝胶的机械强 度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两 种凝胶，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以 比较快。 琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范 围很广，适合于分离大分子物质，但分辨 率较低。琼脂糖凝胶不耐高温。
3.温度对酶活力的影响
取 PPO 粗酶液、醋酸缓冲液、儿茶酚(底 物)溶液，分别于5 、10 、20、30、35、 40、45、50、55 、60 、65℃温度下保温 2.0min，测定PPO 的活力和确定P P O 最 适反应温度。
4.PPO 的热稳定性
将粗酶液分别在20、40、60、80℃ 条件下分别保温0.0、3.0、7.0、15.0、 25.0min 后，测定PPO的活力和确定 P P O 最适反应温度。
凝胶层析
层析系统
装柱 平衡 加样 洗脱 收集
层析柱
梯度混合仪
恒流泵
部分收集器
活性酶的提取 用磷酸缓冲液将丙酮粉溶解 离心 沉淀再用磷酸缓冲液提 取1次 合并2次离心后上清液 浓缩 粗酶
(NH4)2SO4分级沉淀 (NH4)2SO4按质量浓度进行9个 分级 加入粗酶液中 0℃ 下静置 离心 上清液再加 入下一级的(NH4)2SO4浓度（重 复操作，测定每次沉淀的酶活性 和蛋白含量）
PPO测定 1.酶对底物专一性 取酶液,加磷酸缓冲液,再迅速加 入邻苯二酚,摇匀后在10min, 20min, 30min时测光密度。同样，以对甲 酚，对苯二酚，酪氨酸，间苯二酚 为底物进行测定。
2.pH对酶活力的影响 取6份酶液, 同时取对苯二酚溶液,也 为6份,混合并分别加入pH从5.8,6.2, 6.6, 7.0, 7.4,7.8磷酸缓冲液各2ml,反应 10min, 20min,30min,测定在410nm处的 光密度。
PPO的纯化常采用盐析法。盐析主 要是利用酶蛋白在高浓度的盐溶液 中溶解度减小而析出的原理。硫酸 按由于价廉、溶解度大，且能使蛋 白质稳定，故是最常用的盐析剂。
多酚氧化酶的SDS-PAGE电泳纯 度鉴定、分子量测定 常用SDS-PAGE电泳对多酚氧化酶 的纯度和分子量进行测定，并推 测同工酶的数量。
5.抑制剂对PPO活性的影响
将磷酸缓冲液分别与每种抑制 剂混合,置于水浴保温。取酶液, 对苯 二酚溶液同时保温,迅速混合后保温, 分别和多种溶液抑制剂混合,于 410nm处比色测定,参比液是不加抑 制剂的酶活性。
• 葡聚糖凝胶 Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、 弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的。 强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解 断裂，所以要避免Sephadex与强酸和氧化 剂接触。Sephadex在高温下稳定，可以煮 沸消毒。 在用Sephadex进行凝胶层析实验时常 使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液。
现在PPO的应用多用于提高植物对病原 菌的抗性。 PPO与一些水果和作物的褐化有关。 PPO是决定红茶品质的关键酶类。在啤 酒生产过中,PPO与啤酒风味陈化紧密相 关。反之,为了防止水果褐化,保持水果新 鲜,生产上也运用多种方法降低水果中 PPO活性和含量。
提取和纯化
制备丙酮粉（ 4℃ ）
- 30℃的果实解冻 与丙 酮-蒸馏水混合 粉碎 抽滤 滤渣用-30 ℃的丙 酮冲洗 滤渣既为丙酮 粉 室温下晾干。
Sephadex的机械稳定性相对较差， 不耐压，要求流速较慢，不能实现快速 而高效的分离。 Sephadex LH-20和LH-60是在 Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基 基团形成LH型烷基化葡聚糖凝胶，适 用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性 物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。
琼脂糖凝胶