大花红景天组织培养试验西藏自治区农牧科学院中心实验室发布时间：2008-11-06 来源：中国西藏信息中心作者：白玛玉珍李宝海次仁措姆李顺凯达娃[进入论坛][打印本稿][发表评论][关闭窗口][摘要]：通过对大花红景天[Rhodiola crenulata(Hook．f．et Thoms．)S．H．Fu]不同外植体叶、茎、根进行离体培养，结果表明；采用7O%的乙醇消毒材料30s，再用0．1%的升汞消毒5-10min较适合根、茎、叶外植体的消毒，而采用7O%的乙醇消毒材料30s，再用0．1%的升汞消毒20-25min适合红景天种子的消毒，污染率仅8%；不同外植体愈伤组织诱导与分化能力不同，叶片愈伤组织诱导和分化率最高，分别为70%与14.3%；外植体诱导愈伤组织和分化成苗的能力与植物生长调剂、蔗糖浓度等因素有关，最适愈伤组织诱导培养基为附加6-BA0.5mg／L+2,4-D3.0mg／L或6一BA0.5mg／L+NAA 3.0mg／L的1/2Ms，生根培养基为附加IAA的1/2Ms，蔗糖浓度为3%时，愈伤组织结构松散、红或绿色愈伤组织诱芽容易。
[关键词]：大花红景天外植体愈伤诱导分化激素蔗糖A Test for Tissue Culture of Rhodiola CrenulataBaima Yuzhen Li baohai Tsring Tsomo Li sunkai Dawa（The center of quality and safety supervision, inspection and examination for Agricultural products in Lhasa,Ministry of Agriculture,PR.China. 8500032）Abstract:The Different explants(leaf, root and stem) of Rhodiola Crenulata were cultivated and studied in separate culture mediums. The results showed: 70% ethanol 30 seconds with 0.1% HgCl2 5-10 minutes are having a moderate sterilizing effects on root,stem and leaf; 70% ethanol 30 seconds with 0.1% HgCl220-25 minutes present a good sterilizing effects on seeds of Rhodiola Crenulata, which leave only 8% of contamination rate; Different callus of explants demonstrate varying abilities of induction and differentiation, leaf callus shows a high rate of induction and differentiation, they are 70% and 14.3% respectively; It shows that the ability of callus induction and the differentiation ability for a callus successfully turning to shoot have a strong link with the factors of plant’s auxin and sucrose’s concentration etc. The best culture medium for callus induction is 6-BA 0.5mg/L + 2,4-D 3.0mg/L or 6-BA 0.5mg/L + NAA 3.0mg/L, the best one for root is IAA with 3% concentration of sucrose. It is proved red and green callus or callus witha loose structure present a good ability for turning to sprout.Keyword:Callus induction, Rhodiola Crenulata, Hormone, Sucrose, Explant, Differentiation大花红景天Rhodiola crenulata(Hook．f．et Thoms．)S．H．Fu]属景天科多年生草本植物,又称宽瓣红景天、圆齿红景天,藏语称苏罗马保,为2005年版《中国药典》收载品种。
分布在云南西北部、四川西部和西北部、西藏和青海省,多生长在海拔2800~5000米的山坡草地、灌丛及石缝中。
经受长期缺氧、干燥及强紫外线等恶劣环境的影响，形成独特的营养成分，含有丰富的红景天甙、黄酮、多种维生素和微量元素，还含有机体所必需的17种氨基酸。
具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、延缓机体衰老、防止老年疾病、抗微波辐射及兴奋大脑和脊髓等多种功能，是一种适用于特殊地区开发、用以增强人体适应能力的药物。
另外，也可以研制成饮料饮用⑴。
近年来，随着人们对大花红景天的不断深入研究与开发利用，自然状态生长的大花红景天资源受到了严重的威胁。
因此．加快其人工繁殖，缓解资源开发与保护的矛盾已成为当务之急,采用试管技术繁殖大花红景天种苗并进行人工栽培有助于解决这一问题。
1、材料与方法1.1 试验材料本试验材料为大花红景天(Rhodiola crenulata)的茎、叶、叶柄、根，来源于西藏自治区拉萨市墨竹工卡县,工卡镇，日土乡，海拔4800米以上。
1.2 试验方法1.2.1 外植体的处理分别选取大花红景天幼嫩的茎、叶、根、种子作为外植体，在超净工作台上，用7O%的乙醇消毒材料30s；用7O%的乙醇消毒材料30s，再用0．1%的升汞消毒5-25min。
然后用灭过菌的无菌水冲洗3-5次，再用无菌滤纸将外植体表面的水吸干，将其切成大小相近的小块(约5mm的叶片)，然后接种到培养基上，每个处理30-50瓶，每瓶1-2个外植体。
培养1周后调查污染情况，污染率（%）=（污染外植体/接种外植体）×100。
1.2.2 愈伤组织的诱导和分化外植体MS基本培养基上生长一周后，将试管苗叶切成小块接种到MS基本培养基和附加不同浓度NAA、2，4-D和6-BA的各种培养基上，用于筛选诱导愈伤组织和分化最佳培养基；蔗糖浓度设为2%、3%、4%，每个处理分别接种茎、叶、根三种外植体，比较蔗糖对其离体培养再生的影响；在1/2MS+6-BA0.5mg/l+2,4-D3.0mg/l+蔗糖3%的培养基上，接种茎、叶、根比较不同外植体离体培养再生效果。
1.2.3 根的诱导和试管苗的移栽切取高2-3cm或2-4片叶的芽体与带茎节切段，接种于附加IAA的1/2Ms培养基上诱导生根，用珍珠岩、砂子、腐植土、园土以一定比列混合的基质进行移栽。
上述试验所采用的基本培养基是MS培养基，附加各种激素，每升培养基加琼脂6g，各种培养基的pH 值均为5.8；光照1O-16h／d，光照强度约为1500-2000Lx，结合自然光照8OOLx左右。
2、结果与分析2.1 不同消毒方法对外植体接种污染的影响从表1可以看出，仅用70%的乙醇消毒的外植体污染率较高，用7O%的乙醇消毒材料30s，再用0．1%的升汞消毒5-10min或用7O%的乙醇消毒材料30s，再用0．1%的升汞消毒20-25min后接种的外植体污染率较低，说明0.1%升汞消毒对红景天外植体接种污染有一定效果.四种外植体用第一种消毒方法污染率最高，第三种消毒方法污染率最低，但第三种消毒方法使茎、叶、根三种外植体褐变率达90%以上，因此，第二种消毒方法较适合茎、叶、根三种外植体的消毒，而第三种方法使用于种子的消毒。
2.2 不同外植体愈伤组织诱导和分化比较试验观察到，大花红景天不同外植体培养过程中愈伤组织诱导与分化十分缓慢。
茎、叶、根三种外植体中,叶片外植体的愈伤组织诱导率和分化率最高，分别为70%与14.3%（表2）2.3 植物生长调节剂对外植体愈伤组织诱导和分化的影响激素是植物组织培养器官分化的关键因素，形成器官的类型由培养基中不同激素的相对浓度控制，而不是这些物质的绝对浓度决定(2)。
将叶片接种于附加2，4-D、AB、NAA的12种培养基，结果（表3）表明，在6-BA0.5mg／L+2,4-D3.0mg／L或6一BA0.5mg／L+NAA 3.0mg／L的1/2Ms培养基对叶片愈伤组织诱导率最高，分别达到70%与72%。
随着BA浓度的升高，外植体愈伤组织诱导能力有所提高，可见，适当的BA浓度与2，4-D、NAA配合有利于叶片外植体的诱导。
2.4 蔗糖浓度对外植体愈伤组织诱导及分化的影响蔗糖浓度为3%时，三种外植体愈伤组织率和分化率均较高，（表4）。
蔗糖浓度为2%、4%时，虽外植体的愈伤组织诱导率高，但分化率很低，其中茎外植体愈伤组织分化成苗率为0，可见诱导愈伤组织培养基适宜的蔗糖浓度为3%。
2.5 根的诱导和试管苗的移栽切取高2—3cm的芽体，接种于生根培养基上，生根培养基以1／2Ms附加0．5mg／mlIAA效果较好，7—10d即可产生根原基突起。
1O～25d后，根长3～5cm，平均每株生根5条，生根率达98％(图E)。
待苗高达4cm以上进行移栽，移栽前将具生根苗的三角瓶盖打开，于实验室温度、散射光下炼苗3-4天；用镊子取出小苗后，洗去根部培养基，移栽于珍珠岩、砂子、腐植土、园土以一定比列混合的基质中，并加盖透光塑料膜，1周后去膜。
移栽成活率达75％以上，如果瓶苗形成木质化根，移栽成活率达95%。
A B CＤＥＦA 刚接种的叶片外肢体；B.8周后基部开始形成愈伤组织；C.16周后叶片外植体分化出芽；D.28周后叶片外植体芽的增殖；E.转入生根培养基2周后生根情况；F.生根培养6周后可移栽的植株。
3、讨论在本研究中，以大花红景天叶片、根、茎作为外植体，全面研究其愈伤诱导形成的适宜条件：在愈伤组织诱导方面，以叶片作为外植体诱导组织效果最好，诱导频率可达70%以上，三种类型的愈伤组织中，结构疏松、呈颗粒状的绿色或红色愈伤组织分化能力最强，不同激素种类和浓度的组合对愈伤组织的诱导效果不同。
本实验采用2，4-D、BA与NAA配合对大花红景天诱导成苗效果较好，得到最佳诱导愈伤组织培养基为1/2Ms+6-BA0.5mg／L+2,4-D3.0mg／L或1/2Ms+6一BA0.5mg／L+NAA 3.0mg／L。