核酸研究进展
内容简介
▪ 核酸的发现和研究概貌 ▪ 核酸基础 ▪ 基因组与基因组学 ▪ 核酸结构与结构预测
核酸的发现和研究工作进展
1868年 Fredric Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人肺炎球菌转化试验 1952年Hershey等噬菌体转化试验， 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 1958 Crick提出的中心法则 1968年 Nirenberg发现遗传密码 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法 1985年 Mullis发明PCR 技术 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) 1994年 中国人类基因组计划启动 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架 后基因时代
▪ 考察相邻的二核苷酸对，发现碱基组成相同，但嘌 呤和嘧啶的排列顺序不同，双螺旋的稳定性具有显著 的差异。
▪ 例如5′GC3′,3′CG5′和5′GC3′,3′GC5′，前者的稳定 性远大于后者。它们的氢键数目是相同的，它们的差 别在于相邻碱基之间堆积力不同。即从嘌呤到嘧啶的 方向的碱基堆积作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌 呤方向的碱基堆集作用。这是因为前者的嘌呤环和嘧 啶环重迭面积大于后者的嘧啶环和嘌呤环的重迭面积， 这在B型DNA中确是如此。
DNA序列分析 (DNA sequencing)
双脱氧链终止法 Sanger DNA的自动测序
DNA化学降解法 Maxam Gilbert
DNA序列分析简单回顾
▪ DNA测序方法两位科学家的发明起了决定性作用：
第一位是Frederick Sanger，1977年发明的DNA测序方法。
第二位是Leroy Hood和同事Michael Hunkapiller及Lloyd Smith在1986年对Sanger的方法作了改进。Hood的发明自 动测序仪。首先用荧光方法取代了放射方法，然后采用激光 和电脑来自动读取测序结果。
▪ 后来，Fresco等用亲和色谱法确认R·RY型三螺旋 中也包括A·AU∕I、I·AU∕T和I·GC三螺旋。
▪ 随后，又确认了G·GC、A·GC和T·AT 3种典型的 R·RY型三螺旋，以及C·AT、A·GC和T·CG等相互 作用较弱的三螺旋。研究发现R·RY型三螺旋 （C·AT、A·GC和A·AT等）第三条嘌呤链和 Watson-Crick双螺旋的嘌呤链以两个反Hoogsteen氢键相连接，且糖环的二面角限制在 anti区。
螺旋的手性 右旋
右旋
螺旋的旋转周期 33.8A *34.4+2A(32-36A)
大沟
宽度 11.7A **间距:22.6A
深度 8.5A
7A
小沟
宽度 5.7A
间距:12A
深度 7.5A
2A
大沟和小沟有关值
的比较
宽度比2.2 间距比1.88
DNA双螺旋结构的多态性
在生理盐溶液中92%相对湿度下是B型双螺旋。
反向重复序列 (inverted repeats)
回文序列
富含A/T的序列
▪ 在高等生物中，A+T与G＋C的含量差不多 相等，然而在它们的染色体某一区域，A·T含 量可能相当高。 ▪ 在很多有重要调节功能的DNA区段都富含 A·T，特别是在复制起点和启动子的TATA框 的序列中，其对于复制和起始十分重要。因 为A－T对只有二条氢键，此处的双链较G－ C对处易于解开，有利于起始复合物的形成。
以反平行的方式键合，形成反Hoogsteen键。
Hoogsteen键或反Hoogsteen键的形成只是构筑 三螺旋的必要条件；要想使三螺旋具备一定的生物 学功能，实现它的实际应用，还必须保证它具有一 定的稳定性。
影响三螺旋DNA稳定性的因素可分为内部因素和外 部因素两方面。内部因素主要是指链长、碱基序列 组成、骨架本性等因素。这些因素主要是通过影响 第三条链键合时碱基配合的强度、氢键相互作用的 强度以及双链受体重排时的能量大小来影响所形成 的三螺旋的稳定性的。碱基错配对三螺旋稳定性的 影响很大。
DNA自动测序结果举例
DNA化学降解法
基本步骤: (1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射 性同位素32P； (2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定 碱基的化学修饰； (3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链； (4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开； (5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA 的核苷酸序列。
DNA双螺旋结构的多态性
B-DNA与Z-DNA的比较
比较内容
B-DNA
Z-DNA
螺旋手性
右旋
左旋
螺旋周期的核苷酸数目 10
12
螺旋直径
20A
18A
碱基平面的间距 3.4A
3.7A
螺距
34A
45A
相邻碱基对间的转角36A
60A
轴心与碱基的关系 穿过碱基对 不穿过碱基对
B-DNA结构参数
性质
X射线衍射分析 STM分析
影响三链核酸稳定性的外界因素主要包括溶液的pH 值、溶液中阳离子的浓度、配基结合作用力的大小 等。
“嘧啶型”或嘧啶-嘌呤-嘧啶（Y·RY）型三螺旋
Arnott等提出的三螺旋为A型DNA，糖环构象是N型（C3′endo），一个周期含有12个核苷酸，平均碱基高度为32.6nm， 有较负的X位移（-32根据试验结果提出三螺旋核酸 的概念。
▪70年代初，Arrnott等根据X射线衍射结果，建立了 三螺旋核酸简单分子模型。
▪三螺旋DNA的结构单元是三碱基体，有两种基本类型：
一种是嘧啶-嘌呤-嘧啶型三碱基体(Py-型) ；
另一种则是嘌呤-嘌呤-嘧啶三碱基体(Pu—型) 。 ▪1987年Ｍirkin等在酸性溶液的质粒中发现Ｈ-型三螺 旋ＤＮＡ， ▪1987年Ｄervan等通过将第三股ＤＮＡ粘接到天然Ｄ ＮＡ上。结果表明，三螺旋ＤＮＡ的形成可能伴随于 ＤＮＡ转录、复制和重组等细胞过程。
▪ 第一台自动测序仪由Applied Biosystems公司制造成功，
一天能够产出4,800个DNA序列碱基。今天，市场上的测序 仪仍然采用这种设计。
▪ 今天已经趋向于采用毛细管阵列电泳（capillaries arrays
electrophoresis）技术。Applied Biosystems的毛细阵列 电泳DNA分析仪3730xl能够并行处理96孔板，一天可测出 大约200万碱基。
然而，三螺旋究竟是A型还是B型或者是两者的混合体还需要进 一步实验去证实。
▪ “嘌呤型”或嘌呤-嘌呤-嘧啶型（R·RY）三螺旋中， 第三条嘌呤链以反平行于Watson-Crick双螺旋嘌 呤链的方向缠绕到双螺旋的大沟上，专一性地与嘌 呤链结合。
▪ 早期，在利用光谱学和超分离测量方法探索三链复 合物时发现了G·GC和I·IC两种R·RY型三螺旋。
双脱氧链终止法
双脱氧链终止法
310型全自动DNA测序仪
DNA的自动测序
DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA 序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记 四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应， 反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分 离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上 的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检 测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排 列顺序。
在钾离子相对湿度为75%时，DNA分子是A构象。一般说来，A －T丰富的DNA片段常呈B－DNA。
用乙醇沉淀法纯化DNA时，DNA由B-DNA经C-DNA，最终变 为A-DNA。
若DNA双链中一条链被相应的RNA链所替换，会变成A－DNA。
当DNA处于转录状态时，DNA模板链与由它转录的RNA链间形 成的双链就是A－DNA。
是三螺旋，还可以是千奇百怪的折叠弯曲。
▪ 目前已经发现DNA至少有9种特殊结构，而且随着
研究的深入，发现DNA的结构还会增多。相对于 现有的经典双螺旋DNA结构，其他DNA结构也许 处于非主流地位。
▪ DNA结构的多样性对人类认识人和生物的多样性，
以及生命现象的多样性具有关键作用，至少有助于 人类治疗疾病、开发新药以及理解生命的本质。
一个长达数十年的专利申请也许会重写发明DNA自动 测序仪的历史。 据美国《科学》杂志报道，位于纽约 的一家小型生物技术公司Enzo Biochem ，1982年， 申请DNA自动测序专利。今年11月中旬，美国专利和 商标局裁定：Enzo Biochem的这项技术含有与1998
年授予加州理工学院前任生物学家黎若伊·胡德和同事 的发明专利相同的发明。胡德等的这项专利为加州理工 学院拥有，该技术目前支撑着70亿美元的DNA测序工 业。 Enzo经过律师数十年不懈努力赢得这个专利。位 于加州福斯特城的应用生物系统公司（Applied Biosystem）是购买的胡德专利，在2006年公司测序 仪的收入为5.4亿美元，加州理工学院因此专利而每年 拥有数百万美元的版税收入。专利和商标局的决定让加 州理工学院和应用生物系统公司的财务状态处于危险之 中。双方就谁是技术的第一发明者争执不已，答案还有 待实验室的记录本和日程表公布之后才会出现。
Howard等根据红外光谱及偏端霉素A的嵌入实验提出Y·RY型构 象上采取B型，其糖环构象是C2′-endo（S型），3条核苷酸链 都有相同的糖-磷酸主链构象。在两个反平行的T链间存在一个二 重对称轴。d(T)n·d(A)n·d(T)n的B型结构比A型在能量上更优 越，
同时Raghunathan等给出了B型三螺旋结构模型的初始坐标。 分子模型和振动谱的研究表明在d(G)n·d(G)n·d(C)n和 d(G)n·d(A)n·d(T)n三螺旋中，S型和N型糖环构象都存在，糖 环的二面角在anti区。d(C)n链是S型，Watson-Crick中的 d(G)n链是N型。