糖基转移酶与糖基转移酶抑制剂摘要：糖基转移酶在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。

其是糖蛋白、糖脂中糖链生物合成的关键酶之一。

与此同时，对糖基化抑制剂的研究也是必要的。

两者在治疗一些因为糖基转移酶非正常表达引起的疾病有很大作用。

关键词：糖基转移酶；糖基化；糖基化抑制剂前言：糖基转移酶是广泛存在于内质网和高尔基体内的一大类酶，参与体内重要生物活性物质如糖蛋白和糖脂中糖链的合成，其作用是把相应的活性供体(通常是二磷酸核苷NDP-糖)的单糖部分转移至糖、蛋白质、脂类和核酸等，完成后者的糖基化加工，实现其生物学功能。

因此糖基转移酶的表达和活性的变化与许多疾病联系在一起，并可作为某些疾病的诊断标志，如α-1,3-半乳糖基转移酶活性在体内的再现会引发自身免疫反应，导致类风湿，并在器官异体移植中引起排斥反应；N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶、岩藻糖基转移酶等在成熟细胞中活性的明显升高被视为肿瘤发生的重要标志，并且被认为是肿瘤迁移恶化的重要原因。

因此设计合成糖基转移酶抑制剂，对于寻找抗肿瘤、抗免疫系统等新药研究有重要意义。

1 糖基转移酶的存在糖蛋白是通过蛋白质的糖基化组装实现的，而糖基化过程则通过多种糖基转移酶完成——在肽链合成的同时或合成后，在糖基转移酶的催化下，糖链被连接到肽链的特定糖基化位点上。

糖基转移酶具有高度的底物专一性，即同时对糖基的供体和受体具有专一性。

对糖基转移酶进行研究，是糖基化研究的第1步。

目前已对多种糖基转移酶的结构以及编码它们的基因研究清楚,并认为糖链的合成没有特定的模板，而是通过糖基转移酶将糖基由其供体转移到受体上。

糖链可以认为是基因的次级产物,一个基因编码一个糖基转移酶,一个糖基转移酶专一地催化一个糖苷键的合成；这样一条糖链的合成就需要一个多酶系统,也就对应了一个基因组。

下文简要介绍几类重要的糖基转移酶。

1.1 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosa-minyl-transferase,Gnt)糖蛋白中糖链通过还原端的N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键与蛋白质肽链上Asn-XXX-Ser/Thr序列(XXX为除脯氨酸以外的氨基酸)中Asn残基上的氨基(-NH2)相连，被称为N-糖链。

真核细胞中N-糖链的合成途径高度保守，其第1步合成由GnT完成。

1999年, Strasser等依据动物GnT保守区序列设计简并引物，从烟草文库中分离到编码GnT的基因GnTI，这也是植物中第1个被鉴定的GnT基因。

随后利用同样的方法从拟南芥、马铃薯中分离和鉴定出一系列GnT基因, 这些基因与动物GnT基因均有较高的序列相似性。

后续研究发现GnTI定位于植物的内质网和高尔基体，而减弱了GnTI活力的植株并不对其下游的其它糖基转移酶活力构成影响，说明植物体内具有GnTI的功能类似物。

不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应1.2 多肽N—乙酰氨基半乳糖转移酶（polypeptide-N-acetylgalactos aminyltrase,ppGalNAc）O-连接糖链有多种形式，在动物中研究最深入的是O-乙酰氨基半乳糖(O-GalNAc)连接糖链，该糖链通过还原端的N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)以β-1,4糖苷键与蛋白质肽链上Ser 或Thr的氧原子连接。

ppGalNAc催化O-GalNAc连接糖链合成的第1步，将UDP-GalNAc上的GalNAc基团转移至多肽链上特定序列中的Ser或Thr的羟基上，从而合成GalNAc-O-Ser/Thr 糖蛋白片段。

但植物中与O-GalNAc连接糖链相关的研究十分罕见，仅有2篇报道：1999年Kishimoto等人报道水稻的谷蛋白中含有O-GalNAc连接糖链；最近Kilcoyne等(2009)发现在醇溶的水稻蛋白中也存在O-GalNAc连接的糖蛋白，但尚未鉴定出此蛋白质。

目前研究者尚未得到植物中的任何ppGalNAc基因，这也将是今后开展植物糖生物学研究的一个较好切入点。

1.3 O-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)与前述2种糖基化多发生在内质网和高尔基体不同，近年来在细胞核和细胞质中发现存在另一种O连接N-乙酰氨基葡萄糖糖基化(O-GlcNAc)过程。

O-GlcNAc糖基化修饰在细胞内分布广泛，指通过OGT将单个N-GlcNAc添加到蛋白质的Ser或Thr残基上。

这种作用与蛋白磷酸化作用类似，O-GlcNAc修饰很可能通过改变蛋白的细微结构或形成空间位阻从而抑制该肽链临近位置的磷酸化，从而共同参与转录调控、信号转导等生命活动。

这种被称作“阴阳调控”的关系在全细胞水平和特定蛋白的特定位点上都已得到验证。

2.糖基化糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。

根据糖链和肽链的连接方式的不同,蛋白质的糖基化可分为N-糖基化和O-糖基化。

N-糖基化是通过糖链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖(Glc-NAc)和肽链中某些Asn侧链酰氨基上的氮原子相连。

能接有糖链的Asn必须处于Asn-X-Ser/Thr3残基构成的基序(motif)中,其中X可为除Pro的任意的氨基酸残基。

O-糖基化的结构比N-糖基化简单,一般糖链较短,但是种类比N-糖基化多得多。

肽链中可以糖基化的主要是Ser和Thr,此外还有酪氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸,连接的位点是这些残基侧链上的羟基氧原子。

2.1 蛋白质糖基化过程蛋白质分子表面的糖链可对蛋白质分子的结构产生深远的影响，由此衍生了一种所谓的蛋白质糖基化工程，其是通过对蛋白质表面的糖链进行改造,从而改良蛋白质性质的一种技术。

常用的对糖链进行改造的方法有：(1)通过定点突变技术增加或减少蛋白质的糖基化位点,从而增加或减少蛋白质表面的糖链。

(2)在体外通过化学或酶法[对糖链进行修饰。

(3)细胞内由一系列糖苷酶和糖基转移酶组装成糖基化途径(glycosy lation pathway)来催化蛋白质的糖基化。

通过基因工程手段改变宿主细胞内糖基化途径中糖苷酶和糖基转移酶的表达，即可改变在该系统中表达的糖蛋白的糖基化形式。

目前已通过该方式对酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、昆虫细胞、CHO细胞及转基因植物等多个表达系统进行了糖基化工程的改造。

(4)研究表明，糖基化还受到细胞培养条件的影响。

可通过改变细胞培养过程中培养基的糖分、激素及氨离子浓度等条件来改变蛋白质的糖基化。

3.糖基化抑制剂目前糖基转移酶抑制剂的设计主要是基于其典型的糖基化反应过渡态结构(图1)，两种过渡态模式，一种是构型翻转模式，一种是构型保持模式来进行的, 该反应过渡态包含四个部分(糖供体、受体、金属离子Mn2＋、核苷)共同作用的复杂体系。

此外，由于糖基转移酶的特异性和多样性，以及酶的立体结构和催化机制仍不十分明确，大大增加了酶抑制剂设计合成的难度。

尽管如此，近年来糖基转移酶抑制剂的研究取得了显著进展，有些抑制剂的活性达到nmol/L级。

下文就现有的几类抑制剂，每类选取一种抑制剂进行叙述。

3.1 亚氨基糖衍生物亚氨基糖(Iminosugar)是一类糖环上氧原子被氮取代的糖类衍生物，又称为氮杂糖(Azasugar)，由于该类化合物与单糖结构相似，且在体内更易质子化形成阳离子中间体，与酶活性中心的酸负离子结合，组成稳定的过渡态，从而表现出强的糖苷酶抑制活性。

而糖基转移酶与糖苷酶有类似的反应过渡态(作用机制)，因此亚氨基糖作为糖基转移酶抑制剂的研究较多，已有多篇综述报道，图2列出了部分活性较高的亚氨基糖。

化合物1是一类结构简单但活性很高的选择性α-半乳糖基转移酶抑制剂，而化合物2～4具有很好的选择性岩藻糖基转移酶抑制活性。

化合物4在2 µmol/L的GDP(鸟嘌呤核苷-5'-二磷酸二钠)的参与下，表现出更强的协同抑制效果。

真核细胞内部通常含有µmol级的GDP，在使用亚氨基糖作为岩藻糖基转移酶抑制剂的体内测试时，也能观察到协同抑制作用。

这表明GDP与亚氨基糖可能在酶活性中心形成了复合体共同参与酶反应过程[25]。

2005年, Behr等在寻找抗真菌药物的研究中发现多羟基吡咯化合物5 (6-deoxy-homo DMDP)对啤酒酵母的几丁质合成酶(该酶催化N-乙酰基-D-氨基葡萄糖聚合形成几丁质，其抑制剂可用于抗真菌药物的开发)有很强的抑制作用，进而考察了其异构体6的活性，并在该类化合物的结构基础上合成了两类化合物，以探讨其几丁质合成酶抑制活性和构效关系。

结果显示，两类化合物的抑制活性(表1)较化合物5的要低，其原因可能是由于化合物结构或构型的改变，使其不能更好的被酶识别。

3.2 碳糖苷衍生物碳苷(C-glycosides)是糖环异头碳直接与碳原子相连接的糖苷衍生物，由于其对酸和酶催化水解的卓越稳定性，自20世纪70年代初，引起糖化学家和生物有机化学家的浓厚兴趣，广泛用作糖苷酶、糖基转移酶抑制剂和糖类药物设计合成的先导化合物。

3.2.1 半乳糖基转移酶抑制剂半乳糖基转移酶催化UDP(尿嘧啶核苷-5'-二磷酸钠)-半乳糖上的半乳糖基连接到N-乙酰氨基葡萄糖3位或4位羟基上。

由于半乳糖基转移酶催化许多重要的细胞表面的低聚糖如血型抗原和肿瘤、免疫过程涉及到的E-selectin凝集素Sialy Lewis X等的生物合成而受到广泛关注，其抑制剂可用于治疗器官移植排异等免疫系统疾病。

Vidal等[29]根据酶催化反应过渡态特点，设计合成了碳苷化合物17，化合物对β-1,4-半乳糖基转移酶很好的抑制活性(IC50＝40 µmol/L)，与酶天然底物UDP-半乳糖(Km＝51 µmol/L) (Km为米氏常数)相当。

化合物18没有抑制活性说明核苷部分对保证抑制剂活性是必须的。

分别以岩藻糖基和2-N-乙酰氨基葡萄糖基代替17中的半乳糖基得到的化合物19和20，对岩藻糖基转移酶(Fut3)和N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶(LgtA)的抑制活性却并不高，分别为IC50＝2 mmol/L和IC50＝3.5 mmol/L(相应天然底物的Km值分别为43和540 µmol/L)。

3.3氧糖苷衍生物3.3.1 岩藻糖基转移酶抑制剂研究表明2位N-乙酰氨基乳糖是大多数糖基转移酶的受体底物，而其2'和6位羟基在许多酶识别过程中并不必要，但有可能与酶活性结合部位以外的其它部位作用，所以在这两个位置进行结构修饰有可能获得活性更高的化合物，以作为低聚糖生物合成及代谢过程中的选择性抑制剂. Galan等合成了乙酰氨基乳糖类似物50～62，作为受体底物探讨2'和6位不同取代基对不同的糖基转移酶(人重组α-1,3-岩藻糖基转移酶VI和鼠肝重组α-2,6-唾液酸基转移酶)的活性影响。