5
4 12 3
4
5 13 3
6
4 12 2
11(91.67)
4(80) 10(71.4) 3(75)
3(25)
3(60) 11(78.5) 2(50)
各类熟食
总计
50
478
18
57
16(88.9)
47(82.5)
13
12
14
14(77.78)
46(80.7)
11(61.1)
30(52.6)
LM的实验室检测方法
单核细胞增生性李斯特菌 分离鉴定
上海市疾病预防控制中心 微生物室 许学斌
分类学
单核细胞增生性李斯特菌（人兽共患病原菌）
无害李斯特菌
绵羊李斯特菌伊氏亚种（偶致动物发病）
绵羊李斯特菌伦敦亚种 威氏李斯特菌 斯氏李斯特菌 格氏李斯特菌 默氏李斯特菌
流行病学
• 单核细胞增生性李斯特菌（简称LM）广 泛存在于自然界中，不易被冻融，在土 壤、地表水、污水、废水、植物、青储 饲料、烂菜中均有存在，易被禽畜类动 物食入或在宰杀过程中污染胴体而形成 人的食源性疾病污染源；乳及含乳类制 品是另一大类较易被污染的食品，近年 来，国外加强了对即食类食品（read-toeat）的LM检测。严防“病从口入”。
李斯特菌属生物学特征
• 李斯特菌属为兼性厌氧菌，不产生 芽孢，无分支，革兰阳性短杆菌， 细胞单生或短链状。 • 最适生长温度为30~37℃，但能在 4℃缓慢生长。
一般培养和生化特征
• 李斯特菌属在较老的或粗糙型培养 物上可能呈6~20μm的丝状菌体，在 28℃培养的菌体有1~5根周鞭毛，可 运动，在营养琼脂上37℃培养1~2d 为1~2mm菌落，在45℃角透射光斜 射下呈蓝灰色。
预防和干预措施
• LM在食品的一般热加工处理中能存活， 热处理会杀灭竞争性细菌群，使LM在没 有竞争的环境条件下易于存活，所以在 食品加工中，中心温度必须达到70 ℃持
续2分钟以上。由于可能存在二次污染，因此 蒸煮后防止二次污染是极为重要的。 • 冰箱中的食品可能增加LM食物中毒的危险， 需要加热后食用。 • 加强食品从生产源头到产品流通的全程控制， 提高安全评价标准。
LM的实验室检测方法
• LM分子检测技术 PCR检测技术：用特异引物，一种依据 LM的毒力基因序列设计，常以hlyA、iap、 inl、Dth-18作为靶序列；另一种以LM的 16S序列或16S/23S中间保守区域为靶序 列设计引物。此外，近年被发展的PCRELISA、realtime-PCR等技术是尝试以分 子手段对LM作快速计数。
流行病学
• 食源性病例可以是散发或暴发流行， 主要传播媒介是污染的食品，也有 与食品无关的类似医院内的暴发， 主要发生在托儿所。在部分国家， 其发病率为0.5~0.8例/10万人。 • 发病机理和体液免疫的作用尚不清 楚。
致病性
• LM进入人体后发病与否和宿主的年 龄及免疫状态有关，该菌是一种细 胞内寄生菌，宿主对其的清除主要 依赖细胞免疫机制。
发病机制
• LM由寄生物介导的细胞内增殖，使它附 着及进入肠细胞粘膜与巨细胞吞噬系统； • 抗活化的巨噬细胞，LM有细菌性过氧化 物歧化酶，可使它抗活化巨噬细胞内过 氧化物（杀菌的毒性游离基团）分解作 用。 • 溶血素O，可以从培养物上清夜中获得， 有α 和ß 两种，为毒力因子。
LM的毒力因子
• 李斯特菌溶解素（LLO）： 系由hly基因编码的Hly蛋白，是一 种孔形成毒素，与破坏吞噬体，促 进菌体进入胞液有关，是主要的毒 力因子。 • ActA蛋白 • 磷脂酶C • P60蛋白
致病力检测
• 动物试验可用于分离的李斯特菌的潜在 毒力，如小鼠腹膜内接种、兔眼结膜接 种（Anton）试验、鸡胚绒毛膜尿囊接种。 但并非是常规的，因为大多数刚分离出 的单核细胞增生性李斯特菌株都有毒力。 • 已经建立了一种敏感的免疫抑制小鼠模 型，少量的有毒力菌即可导致小鼠在3d 内死亡。
针对LM的实验室检查原则
临床表现
• 感染LM的孕妇多表现有宫内感染并可发 生早产、流产、死胎，预后险恶。产下 的婴儿常在24~72h内死亡。 • 有时可侵犯上呼吸道而呈现咽峡炎的症 状，常伴有局部淋巴腺炎。 • 可引起人的心内膜炎，并可感染皮肤、 眼睛、泌尿道而引起皮肤损伤、结膜炎、 尿道炎等症状。
临床表现
• 人和动物感染LM时，以血中单核细胞明 显增多为重要特征，为此以前人们误以 为本菌是传染性单核细胞增多症的病原 菌。 • 发生LM的脑膜炎时，脑脊液的单核细胞 和中型粒细胞极度增多，糖下降而蛋白 升高。 • LM脑膜炎的临床症状的多样性和血清检 测无严格的特异性，为本病的诊断带来 一定困难，本病确诊依赖细菌培养。
绵羊李斯特菌哥伦比亚血平板48h菌落形态
绵羊李斯特菌平板在CHROMagar™平板 48h菌落形态（右）
其它李斯特菌在CHROMagar™平板 48h菌落形态
一种添加了半胱氨酸和蛋氨酸的HTM培养基
LM的实验室检测方法
• 数值分类鉴定和新型计数技术 最常用且普遍被认可的是API-Listeria test。 共包括10个生化反应，通过查询代码表 可以对LM和李斯特属内的菌作快速鉴定。 • 传统的计数以平板计数和MPN两种方法 为主。现在有一种经过改良的疏水网膜 （HGMF）技术适用于好氧菌计数，它 采用的ISO-GRIO系统，具有1600个小方 格的网膜，能浓缩样品细菌，除去抑制 物，同时利于细菌在培养基间转移时活 力的恢复。
李斯特菌鉴定
• 除个别菌外，触酶阳性，氧化酶阳 性，水解七叶苷，不水解尿素、明 胶，不产生H2S、吲哚。发酵葡萄糖 和其它种类糖产酸。 • 属的鉴定：革兰染色，湿标本中的 翻转运动试验，触酶阳性，发酵D葡萄糖产酸，水解七叶苷，VP阳性， 甲基红阳性。
李斯特菌鉴定
• 种的鉴定：窄的β溶血环，CAMP表 现和金黄色葡萄球菌有协同溶血作 用，不发酵木糖，微量鉴定系统 API-Listeria（法国生物梅里埃）和 Micro-IDListeria（OrganonTeknika）， 菌落DNA探针杂交。 • 血清型分型确认。
• 显色培养基快速鉴定技术： 针对LM的β-D-葡萄糖苷酶和毒力因子PIPLC酶，设计相应的底物，加入到常规 选择性培养基中，利用酶对底物的分解， 产生荧光物质或显色物质，使其菌落形 态或颜色不同于其它李斯特菌属和非李 斯特菌，从而实现对LM快速鉴定和菌落 数目的快速定量。这是当前开发新型显 色或 荧光鉴别培养基的基本原理。
• 采自正常无菌部位的临床标本可直接 接种在含5%羊、马、兔血的胰大胨琼 脂平板（TSA）上；血标本接种到常规 血培养瓶中；有菌部位的临床标本、 食品及环境标本，在接种平板前应先 选择性增菌。
LM的实验室检测方法
• 传统分离培养检测及鉴定方法： 对于分离培养后的可疑菌落做生化 反应试验、溶血试验、CAMP协同溶 血试验、典型运动及动物试验等鉴 定，被确定为李斯特菌后进一步进 行血清分型；增菌和选择性增菌是 不可缺少的步骤，增菌主要有冷增 菌和快速增菌两种。
流行病学
• 在临床上对成年人（非孕妇）主要 引起脑膜炎、脑炎或败血症；老年 人或免疫力低下者易感。主要损伤 中枢神经系统，死亡率（20~50%）， 预后不良。 • 对孕妇能造成感冒样菌血症，治疗 未及可危及胎儿。 • 潜伏期及感染剂量不明，可以从几 天到2~3个月。
流行病学
• LM的易感对象重点以孕妇为主，也 有新生儿脑膜炎病例和免疫力低下 的全身（中枢）或局部症状发病报 道。 • 由于该菌可通过眼及破损皮肤、粘 膜进入体内而造成感染，性接触也 是一种潜在的传播途径。
LM的实验室检测方法
• 1987年首先报道了针对LM鞭毛抗原的单 克隆抗体ELISA检验程序，可以在2~3d 内从污染样品中检出LM。 • 1992年以特异的单克隆抗体建立的夹心 ELISA方法能于20~24h内检出8~10cfu/g， 第一次做到以免疫学方法把LM与非病原 性李斯特菌分开。 • 2004年报道了以免疫为基础的生物传感 器可以在24h内检测10~100cfu/g样品。
CHROMagar™/BD/Oxoid/ALOA
LM在哥伦比亚血平板、显色平板、 MH血平板上24h的菌落形态
绵羊李斯特菌在哥伦比亚血平板、显 色平板、MH血平板上24h的菌落形态
其它李斯特菌的24h平板形态特征
LM在哥伦比亚血平板48h的溶血菌落
LM在CHROMagar™平板48h菌落形态
LM的毒力因子
• PrfA蛋白 • 内化素 • 表面蛋白P104： 除了内化素外，LM另一种表面蛋白 P104也已被证实对于肠道细胞的粘 附非常重要。
临床表现
• LM有嗜神经性质，所以患者表现以神经 症状最为明显。其中以李斯特性脑膜炎， 神经系统性李斯特病、败血症、脓毒血 症最为凶险，表现为起病急剧，发热 （39℃以上），意识障碍、昏迷、肢体 麻痹以及小脑功能障碍。病人即使幸免 遇难，也常常留下共济失调、失语、眼 球麻痹、肢体瘫痪等后遗症。病死率达 20~30%，使用抗生素治疗可降低病死率。
检测LM的hlyA、23SRNA 多重PCR体系（上海CDC提供）
LM多重PCR（上海CDC提供）
单一或多重PCR检测LM特异基因
其它和LM相关分子检测技术
• 探针检测技术：特异性好。 • BAX-system：自动PCR检测分析， 2002年被英国农业食品和监测局 （FSIS）采纳用来检测鲑鱼中的LM。 有报道利用改良的快速增菌法结合 BAX可以在24h内检测样品的LM。
LM的实验室检测方法
• 我国使用的检测LM方法主要有国标 法（GB4789.30-1994）和SN法 （SN0184-93）。国标法在LEB中增 菌后划线接种MMA平板，再分别于 SIM和TSI上作生化初筛，后于TSAYE平板上纯化后做系统生化鉴定、 报告结果。
不同LM的检测方法应用比较（文献）