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V
＋＋Βιβλιοθήκη 伊氏李斯特氏菌(L.ivanovii) (绵羊)
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＋/＋
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＋
英诺克李斯特氏菌
(L.innocua) (无害)
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＋
＋
＋/＋
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V
－
＋
注：＋阳性；－阴性；V反应不定。
动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM 培养基中，于30℃培养24h-48h，李斯特菌 有动力，呈伞状生长。
H2O(二馏灭菌水) 12.8μl，
10×buffer2.0μl，
Mg2+(25mol/l) 2.0μl， 4×dNTP(10mmol/ml) 1.6μl， Primer(30pmol/μl) 各0.25μl，
Taq E（2.5U/μl）0.1μl
DNA(20-30ng/μl )1.0μl；
增生利斯特菌、伊氏利斯特菌（L.ivanovii）对
小鼠有致病性。
血清学分型:
Lm是根据O抗原和H抗原的差异进行血清 学分型。虽然Lm有16种血清型，1/2a、 1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、 4b、4c、4d、4e、5、6a、6b和7，但只 有3种血清型 (1/2a、1/2b、4b)可引起疾 病。从食品和患者中分离的菌株95％以上 是1/2a，1/2b，1/2c和4b等血清型，而 3a、3b、3c、4a、4c、4e、4d和7等血 清型在食品中非常少见，也没有引起李斯 特菌病的报道。
溶血实验：
将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格 ，从TSA-YE上挑取菌落刺种到血平板上，每 格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李 斯特菌和绵羊李斯特菌)和阴性对照菌(英诺克 李斯特菌)，
于35℃培养24h-48h，穿刺时尽量接近底 部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂 。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增 李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产 生狭小的透明溶血环，无害李斯特菌无溶 血环，伊氏利斯特菌产生大的透明溶血环 。注意：不要据此来区别李斯特氏各种菌 ，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来 确证李斯特氏各种菌。
溶血增强。
金葡
伊氏李
马红
单核
对小鼠的毒力试验 （可选择）
将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中 , 于30℃培养24 h, 离心, 弃上清液，用0.85
无菌生理盐水制备成浓度为1010cfu/mL的菌悬液
, 取此菌悬液进行小鼠腹腔注射 3～5只, 每只 0.5 mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2～5d 内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞
接种木糖、鼠李糖，36 ℃±1 ℃，24 h；同时于TSA-YE平板划线纯化，30 ℃±1 ℃，24 h～48 h
木糖-，鼠李糖+ 鉴定
结果报告
增菌培养:LB1增菌液225 mL，于 30℃培养24h, 吸取0.1 mL，加入 10mL LB2增菌液中二次增菌。
分离培养:LB2 二次增菌液转种于选 择培养基PALCAM和科玛嘉琼脂平板 上，于37℃培养24 h，观察各个平板 上生长的菌落,各个平板上的菌落特征 见表1。
协同溶血试验 (cAMP):
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌
(R.equi), 在它们中两者之间垂直接种可疑李斯特
菌, 但不要触及它们, 于30℃培养24h～48 h, 检查 平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色 葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血
增强, 斯氏李斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增强, 而伊氏李斯特菌（L.ivanovii）在马红球菌附近的
葡萄糖
塔格糖
单增李斯特菌编码:
2410、2510、2550、6010、6110、 6150、6410、6450、6510
VITEK
采用聚合酶链式反应技术（PCR）特异 性扩增单核细胞增生李斯特氏菌溶血 素基因(hlyA)，并评价该方法的特异性 与敏感性。 结果 在706bp处出现nuc 基因的目的片断，只有单增李氏菌的 目的片段获得扩增其它菌种扩增均呈 阴性；该方法可以检测到3.3pg/μl的 DNA。
该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物 中呈短小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状 ，在老龄培养物中呈长丝的长杆菌状，有些 细菌因此而变成革兰氏阴性；为需氧或兼性 厌氧菌，在20～25℃培养时能形成4根鞭毛 ，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛，运动 消失。
1.初筛
在我们前期工作中发现，高污染样品在选择 性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和 减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可 疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须 烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验
李斯特氏菌属
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新
的分类学研究表明，其分为六个种：
单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）
API10300
L.M的API10300鉴定结果
试验
DIM ESC MAN DAPL XYL RHA MDG RIB GIP TAG
有效成分 反应/酶
酶底物
结果 -
浅橙色浅褐色灰褐色
结果 +
橙色
七叶灵水 解
甘露糖苷 酶
阿拉伯糖
浅黄色 无色 红色/橙红色
木糖
黑色
黄色
黄色/橙黄 色
鼠李糖
葡萄糖苷
核糖
MMA
PALCAM
OXA
CHROMagar
30℃48h菌落 针尖大小、形 态不典型，与 杂菌难区分抑 制性强
37℃24h－48h， 30℃24h－ 2mm灰绿色中 48h,2mm灰黑 心黑色凹陷， 色菌落周围呈 菌落周围呈棕 棕黑色水解圈 黑色水解圈
37℃18h-24h, 蓝色菌落周围 呈白色晕圈
菌种
单核细胞增生李斯特氏菌 (L.monocytogenes)
溶血反应 ＋
协同溶血 葡萄糖
＋
＋
麦芽糖 ＋
MR-VP ＋/＋
甘露醇 －
鼠李糖 ＋
木糖 －
七叶苷 ＋
格氏李斯特氏菌 (L.grayi)
斯氏李斯特氏菌 (L.seeligeri)
－
－
＋
＋
＋/＋
＋
－
－
＋
＋
＋
＋
＋
＋/＋
－
－
＋
＋
威氏李斯特氏菌 (L.welshimeri)
引物 针对单核细胞增生李斯特氏菌溶血 素基因（hlyA）设计引物，委托上海生 物工程技术服务有限公司合成。单核细 胞增生李斯特氏菌特异性引物序列如下 ：
上游（F）：
5´-GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC— 3´
下游（R）：
5´--
PCR检测方法：（1）取1ml被检样李斯 特氏菌增菌肉汤用于提取DNA的，模板 DNA的制备， 根据试剂盒说明书进行 ；（2）PCR反应体系：20μl 。
按2009年国家食源性疾病检测网的工作手 册
1.定性检测 2.定量检测
检样 25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质
30 ℃±1 ℃，24 h 0.1 mL+10 mL LB2增菌液
30 ℃±1 ℃，18 h～24 h
科玛嘉李斯特菌显色培养基
PALCAM琼脂
36 ℃±1 ℃，24 h～48 h
L.M在PALCAM培养基生长特征
MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很 难与杂菌区分
进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易 与杂菌区分
CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分 ，对高污染食品中的杂菌抑制性较差
染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片 检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为 0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制 成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌 出现轻微旋转或翻滚样的运动。
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知识回顾Knowledge Review
初筛及纯培养
自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典 型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李 糖发酵管，于37℃培养24h；同时在胰 酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）平板上 划线纯化，于30℃培养24h-48h。木糖 阴性为蓝色，鼠李糖阳性为黄色，在 TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。
单增李斯特氏菌生化性状与其种间的区别
在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核 增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动 物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类 的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌 中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主 要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界中。 肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污染。 该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健 康的主要病原菌之一。 其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大 多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例， 死亡率为13-34% 加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发， 导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的 单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。