Western Blotting间接法操作流程
Western Blotting 设计标准
膜的选择 分子量 标准
显色结果
抗体
不可小看“蛋白标准”--分子量标准的选择
预染分子 量标准
修饰分子 量标准
预混分子 量标准
分子量标准
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不可小看“蛋白标准”--分子量标准的选择
• 预混分子量标准
高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准
Western blot 、蛋白质 双向电泳的原 理、方法及在 医学中的应用 (最终版)
CONTENTS
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1
Western blot 原理及方法
应用
2
蛋白质双向电 泳的原理
蛋白质 双向电 泳的方 法
3
2
1
Western blot原理及方法
蛋白质印迹法
3
Western blotting
Edward M. Southern建立 了将DNA转移到硝酸纤维 素膜 （NC膜）上，并利 用DNA－RNA杂交检测特定 的DNA片段的方法 George Stark对电 泳后的蛋白质分子进 行印迹分析从而发明 western印迹技术
• 缺点：
• 1.免疫反应性降低 • 2.无信号二级放大 • 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便
Western Blotting 方法二: 间接法
• 优点：
• • • • 1. 2. 3. 4. 免疫特异性不受标记影响 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） 多种标记的二抗可供选择 可选择不同的Marker
特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定
的方法。
5
为什么要作蛋白质印迹实验 ？
1
研究一些体外的 蛋白质分子，寻 找目的蛋白是否 存在样品当中
2
不同的样品中检 查蛋白质的表达 情况，上调或下 调表达，如疾病 和正常的样品之 间的表达差异性
6
Western Blot的基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一 种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
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化学显色法
方便、便宜、灵敏 度较低、费抗体、 反应慢、线性窄、 不易保存、不能重 新剥离检测
化学发光法
灵敏、快速、节省抗 体、反应快、线性宽、 无害、特异性高、可 重新剥离检测
显色的 方法
同位素法
灵敏度高、不安全 、环境污染、不方 便和半衰期短
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3
蛋白质双向电泳的方法
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技术流程
提出 生物学问题 实验组和对照组样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析
差异蛋白点选取
蛋白酶解及质谱分析
差异蛋白点的成功鉴定
生物学问题的解释
• 预染分子量标准
单色预染 多色预染
• 修饰分子量标准
糖基化 磷酸化 荧光标记
预混分子量标准
• 高分子量标准 • 低分子量标准 • 宽分子量标准
预染分子量标准
• 单色预染 • 多色预染
修饰分子量标准
• 糖基化 • 磷酸化 • 荧光标记
膜—三种选择
2. PVDF膜
灵敏度、分辨 率和蛋白亲和 力比常规的膜 要高，对蛋白 的吸附能力要 远远大于NC膜
1975
1979
McMaster和Carmichael 对RNA进行印迹分析，发 明 Northern印迹技术
同年
最终
Western blotting！！
4
什么是蛋白质印迹法 ？
Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化技术及分 子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在 于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为 电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和
Western Blotting 操作流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
转膜 封闭
一抗孵育
二抗孵育
底物显色
Western Blotting 操作流程
第五步 第三步 第一步
转膜 一抗杂交
底物显色
第四步 第二步
封闭
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二抗杂交
Western Blotting 方法一: 直接法
• 优点：
• 1.快速（一种抗体） • 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带
• 缺点：
• 1. 交叉反应引起的非特异性条带 • 2. 额外的二抗孵育以及条件优化
为什么一般情况下都采用间接法进行检测？
• 直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记可用于很多种 不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一 抗结合不知一个二抗分子，所以二抗可以增强信号，所以一般 情况下都采用间接法进行检测
荧光底物法
Krypton ™荧光底物
2
蛋白质双向电泳的原理
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双向电泳的实验原理
◆第一向：等电聚焦
◆第二向：SDS—PAGE电泳
26Leabharlann 第一向：等电聚焦第二向：SDS—PAGE电泳
• 聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)和交联剂N,N-甲叉丙烯 酰胺(Bis)在加速剂N,N,N’—四甲基乙二胺（TEMED）和催 化剂硫酸铵（AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状 的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGE。
3.后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还 要根据不同目的来挑选不同的转移膜
膜的特点
抗体的选择
• 作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少 一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于 ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异 性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特 异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。 • 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别 凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉 反应条带。
1. 硝酸纤维素膜（NC 膜） 价格便宜，简单 快速封闭与非特 异性抗体结
3. 尼龙膜
对核酸和蛋白 质具有很强的 结合能力，能 代替NC膜用于 分子印迹和杂 交实验。
选择膜的标准
选择标准
1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合 蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）
2.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法， 信噪比好）