比较不同培养基培养脐带间充质干细胞目前的培养体系和培养方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培养基，但含血清培养基使临床细胞治疗受到限制，存在不安全因素。

通过对脐带间充质干细胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）及无血清培养基StemProRMSC SFM的培养扩增，比较三种培养体系的优略。

建立从减血清到无血清的培养体系，减少血清对临床细胞治疗的干扰，提高临床细胞治疗的稳定性与安全性。

标签：有血清培养基;无血清培养基;脐带间充质干细胞随着对脐带间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，脐带间充质干细胞可在体外大量培养扩增，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛的功能。

同时脐带间充质干细胞还具有取材方便，无伦理学限制，免疫原性相对纯净的优势，可以为实验和临床提供足够的细胞来源。

1资料与方法1.1一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4℃保存，6h内无菌處理。

1.2脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank’s液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton胶。

将其剪碎至1mm3组织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20~25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。

3~5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，正向放入体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。

72h后换液，一般5~7d可有间充质干细胞爬出。

1.3脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）、StemProR MSC SFM三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。

1.4 流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1×106个细胞，分别加入10μl单克隆抗体CD73、CD34、CD45、CD105、HLA-DR、HLA-ABC及阴性对照lgG1-PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min，PBS洗涤两次，室温300g，5min。

PBS重悬后上流式细胞仪。

1.5 cck-8 法检测细胞活性取生长状态良好的P4代细胞，调整细胞浓度至0.2×105/ml，加入96孔板。

每孔90μl放在37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内培养。

7d内每日上午10:00取出96孔板用与原来孔内相同培养基100μl 换液后加入cck-8溶液，继续孵育1h。

用酶标仪波长450nm测定各孔OD值。

以OD值代表细胞的相对数量，绘制细胞生长曲线。

2结果2.1细胞形态学观察在细胞植块5~7d可见呈纤维样细胞从植块边缘爬出，散在分布或形成小克隆。

2~3w细胞达到70%左右融合，细胞呈平行或旋涡状排列。

下图为传代培养至P2代细胞，1d后观察无血清培养基StemProRMSC SFM和有血清DMEM/F12中脐带间充质干细胞的生长状态。

2.2流式细胞表型特征流式细胞学检测显示，三种培养体系中人脐带间充质干细胞均不表达造血干细胞标记CD34、CD45、HLA-DR、高表达CD73、CD105、HLA-ABC。

2.3 hUC-MSCs在三种培养体系的生长曲线，见图3。

图3 hUC-MSCs在三种培养体系的生长曲线3三种培养体系的比较3.1 DMEM/F12培养基（不含酚红）早期实验室广泛应用的是Eearle’s MEM 即最低必需培养基。

它是建立在平衡盐溶液（BSS）基础上的，它仅含有12种必须氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。

成分简单，可用于哺乳动物细胞类型的培养。

DMEM与最低必需培养基相比，氨基酸含量为MEM的2倍，又添加了甘氨酸、丝氨酸等非必需氨基酸；维生素含量为MEM的四倍，同时含有酵解途径中的重要物质-丙酮酸和微量的铁离子。

而Ham’s F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，可加入少量血清培养，特别适合于克隆细胞的培养。

脐带间充质干细胞的培养大多使用的是DMEM/F12，它将含有较丰富成分的F12和高浓度营养成分的DMEM 1:1结合，配制成DMEM/F12培养基。

考虑到DMEM/F12可作为无血清培养基的基础，且适用于血清浓度含量较低条件下哺乳动物的细胞培养，故本实验使用DMEM/F12进行原代细胞的培养，为传代扩增更好的适应另两种培养体系做好基础。

本实验选用不含酚红的DMEM/F12。

由于酚红是一种实验诊断药，在常用的DMEM/F12培养基中被用作PH值的指示剂。

中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。

它在无血清培养基中会引起钠/钾失衡，影响细胞生长；在一些雌激素的研究表明，酚红可以模拟固醇类雌激素作用[1],产生固醇类反应。

而且在后期细胞检测中酚红对流式细胞检测会产生干扰，因此本实验选择了不含酚红的培养基进行原代间充质干细胞培养。

3.2 IMDM 培养基IMDM(Iscove’s Modified Dubecco’s Medium ) 又称为伊思柯夫改良培养液。

此种培养基含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES,并用硝酸钾取代了硝酸铁；不含α-硫代甘油；不含碳酸氢钠；含酚红。

IMDM适合高密度细胞培养，适用于成纤维细胞培养，一般加入的血清浓度为20%。

3.3无血清培养基StemProRMSC SFM无血清培养基就是在细胞培养中不添加血清的成分，但要添加替代血清成分的补充因子。

①必需补充因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠。

胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是重要的细胞存活因子[2]。

大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体与转铁蛋白/Fe3+复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源。

微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物歧化酶的作用过程，消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害。

②特殊补充因子：生长因子和激素[3]。

生长因子包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子和神经生长因子等。

③激素除了胰岛素外，大多数的哺乳动物细胞还需要一定量的其它激素如甲状腺素、多肽类激素中的生长激素等。

3.4三种培养体系的比较通过细胞生长曲线我们明显看出在含血清培养基中脐带间充质干细胞在DMEM/F12中的生长状态要明显高于IMDM，同时考虑到IMDM所需的血清浓度高，且含有酚红，不利于后续操作中进行减血清到无血清的培养扩增及流式检测。

因此，实际比较的是DMEM/F12和StemProRMSC SFM 两种培养体系。

不可否认血清成分多样，对细胞生长有很大的促进作用。

但同样存在着一些风险：①取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响。

②血清中含有一些对细胞有毒性的物质，如多氨氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应，形成有细胞毒性作用的聚精胺。

③血清的使用使得实验室和生产的标准化很难达到，尤其在临床细胞治疗中存在很大的风险性。

④批间差异。

上述情况看来无血清培养基是目前实验室培养细胞用培养基的首选，但在脐带间充质干细胞种子细胞的培养中无血清培养基仍不能替代有血清培养基。

因此，采用无血清培养最关键的问题是细胞从有血清培养基到无血清培养基的驯化过程。

4从有血清培养基到无血清培养基的驯化按照细胞对无血清培养基的适应性可将培养方法分为直接适应法和连续适应法。

直接适应法即细胞从添加血清的培养基直接转换到无血清培养基中；连续适应法即分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基中，与直接适应法相比，连续适应对细胞更加温和。

本次试验将含10%血清的DMEM/F12直接传代至StemProRMSC SFM，通过图3三条不同的生长曲线细胞对比显示StemProRMSC SFM生长和增殖都较慢，证明间充质干细胞转入到无血清培养基中需要一个适应性的过程，更适合于连续培养法，将血清浓度从10%逐步减少到5%，3%，1%直到无血清培养。

同时，无血清培养基对细胞的要求较高：必须是对数生长期的细胞，且活率不应低于90%，适应后应该以较高的起始细胞接种；在培养过程中应该对上一代的混合培养物备份，直到细胞适应新的混合培养基。

此外，在适应过程中，不要让细胞过度生长，这样将增加细胞选择亚群的可能性；需要注意的是无血清培养基中含有非常少的蛋白质，更易于受外界因素的影响。

间充质干细胞从有血清培养基到无血清培养基驯化的过程不仅仅是简单的降血清培养，还有很多需要探索的影响细胞生长的因素。

参考文献：[1]Bethois Y,Katzenellenbogen JA,Katzenellenbogen BS. Phenolred in tissueculture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture[J]. ProcNalt Acad SCI USA,1986,83(8):2496-2500.[2]林世康,胡云龙,施国民.动物细胞无血清培养基的应用及研究发展[J].细胞生物学杂志，2000,22（3）:154-157.[3]Gassy MC, Tharakan JP,Chau PC.Serum-free media in hybriddo-ma culture and monocleonal antibody production[J].Biotech ＆Bioeng, 1998,32:1015-1028.。