检测自身免疫抗体的蛋白质芯片技术自身免疫性疾病是由异常免疫反应引起的慢性退行性或炎症性疾病。

不同的自身免疫性疾病对机体的影响各有不同。

例如，在多发性硬化症中，自身免疫反应的侵害对象是中枢神经系统，而在克罗恩病中则是肠道。

此外，同种疾病对不同个体的组织和器官的影响程度不尽相同。

此类疾病的严重程度取决于患者的免疫系统情况。

其人群患病率在3%以上，女性和老年人居多。

炎症是许多此类疾病的常见症状，其他症状包括：眩晕、疲劳、不适及低烧。

器官特异性自身免疫性疾病可侵害靶器官或组织，导致功能受损。

对此类疾病的诊断相当困难，尤其是在发病初期。

对健康个体进行的特异性自身抗体检测表明：不同疾病的阳性结果发生率少则接近0%，多则超过10%。

健康个体中的大多数抗体的滴定浓度都很低，对健康没有不良影响。

自身抗体并不总是针对某种风湿性疾病。

例如，与天然双链DNA (dsDNA) 发生反应的抗体通常对系统性红斑狼疮(SLE)具有诊断意义。

但是，抗双链DNA 抗体也可见于患有其他疾病的个体中，如风湿性关节炎、干燥综合症、硬皮病、药物性狼疮、慢性活动性肝炎、格雷夫斯氏病及其他疾病。

抗双链DNA 抗体在上述疾病的患者中发生率一般低于5%。

因此抗双链DNA 抗体对SLE 没有诊断意义。

在少数情况下，自身抗体具有很强的疾病特异性。

目前已鉴别出一些常见风湿性疾病的自身抗体靶点（表I ）。

本文就自身抗体检测技术进行了回顾性评述，开篇先介绍一些成熟的检测方法，最后则展望未来的发展趋势。

多路复用蛋白质分析技术是讨论的核心焦点。

本文还研究了各种多路复用自身免疫测定法，并阐述了开发人员所面临的困难。

目前的检测方法检测自身免疫相关抗体的第一种方法是琼脂凝胶平板双向扩散法，但是这种方法早已被更快速、更灵敏的半定量方法所取代。

检测血清中自身抗体的常用实验室试验：免疫测定（通常为酶免疫测定）、间接免疫荧光显微技术 (IFA)、免疫印迹及免疫沉淀。

上述试验中只有第一种是半定量试验；其他均为定性试验。

通过IFA 法进行筛查需要耗费大量的人力，而且要求训练有素的技术人员对显微镜染色图谱进行目测解读。

这种方法缺乏可靠的标准，其结果取决于观察者的技能。

IFA 阳性结果并不能确定抗原的存在。

因此，在提出具体治疗方案的建议方面，其作用十分有限。

磁性微粒的扫描电子显微照片，由Bio-Rad Laboratories 公司(美国加州，Hercules)的BioPlex 2200免疫测定系统（该设备具多路复用测定功能）采用。

表I. 针对某些主要风湿性疾病最常用的自身免疫分析技术。

这些方法的最大缺陷是每次分析只能获得一个结果。

通常，为了获得完整的自身抗体检测结果，需要进行多次试验。

长期以来，研究人员希望能够同时检测同一类别的多种分析物，如自身抗体、过敏原及甲状腺功能试验，而多路复用技术的出现使这一目标得以实现。

采用多路复用分析技术时，一份样品可以在同一个反应器中产生多个报告结果。

多路复用技术非常适用于多因素疾病的诊断，这种疾病需要进行多种实验室检测方能做出诊断。

以复合模式（多路复用技术）对合理设定的多种分析物进行分析具有许多优点：· 节约试剂、实验室耗材以及劳动力成本，特别是劳动力成本。

· 通过病人的少量标本即可获得大量信息，这一点对于儿科尤为重要。

· 能够同时检测核酸、抗原、抗体及药物等多种分析物。

· 具有内部质量控制功能，确保试验结果的准确性。

· 样品处理量增大。

· 能够鉴别分析物浓度的图谱。

另外，多路复用技术适应了当今工业和市场的发展趋势，即：劳动力短缺、自动化程度提高、过程标准化以及实验室联合。

芯片技术多路复用蛋白质分析技术最近研制成功，主要包括两种子技术：平板芯片和球形芯片。

平板芯片：该技术采用一块二维微芯片，芯片内含针对各种分析所定义的反应位点。

通过可溶阶段的配合基，平板芯片可以对蛋白质、代谢物及其他分子组成的混合物中的几种固定化蛋白进行同时检测。

几年前，某研究小组制造了一种内置1152个反应位点的自身抗原芯片。

这种平板芯片采用聚左旋赖氨酸包被的玻璃载玻片作为固体载体。

将196种不同的假定自身抗原以4个或8个复制组的形式进行点样，由此产生有序阵列。

结合在固体基质上的蛋白质包括36种重组或纯化蛋白质、6种核酸抗原以及154种重叠和免疫显性合成肽，这些肽来自于核内小分子核糖核蛋白、Sm 抗原蛋白、多聚（二磷酸腺苷-核糖）聚合酶以及H1、H2A 、H3和H4组蛋白。

在芯片内可进行针对磷酸化激活修饰蛋白的抗体试验。

通常以荧光素Cy3标记的羊抗人IgG 作为芯片试验的标记物。

试验可以检测出纳克/毫升浓度水平的抗体，而且线性范围达三个对数。

分析灵敏度一般高于酶联免疫吸附分析法(ELISA)。

此项研究所暴露出的一个技术问题是，几种Sm 抗原和组蛋白因点样技术被灭活了。

据推测，蛋白与固体表面的结合是抗原表位丢失的原因。

研究人员表示，或许可以通过优化结合化学性质或者改进表面包被技术来纠正这一问题。

此外，一些结合在载玻片上的抗原还受到蒸发速度过快的不利影响。

另一组研究人员也进行了一项试验，他们把14种自身抗原复本以及空白对照和校准品点样在聚苯乙烯孔中（图1），然后将辣根过氧化物酶标记的抗人IgG 与可激活的化学发光底物同时使用，并且通过以电荷耦合器件（CCD ）摄像机为基础的芯片图1. 某试验中所用的二维芯片的布局示意图，该芯片内含14种自身抗原(A –N)、阳性(+)和阴性(–)对照以及IgG 校准品，不同位置上校准品的浓度以两倍的速度从1 mg/ml (C1)递增至16 mg/ml (C5)。

检测仪记录到了光信号。

通过人IgG 校准品进行抗体定量。

该技术将最常用的临床试验整合在一块简单的微型芯片上。

就分析结果而言，这种塑料芯片与商用分析试剂盒不相上下。

作为临床试验室和生物医学研究的专用自动化平台，Randox Evidence 采用了蛋白质生物芯片技术，通过CCD 摄像机对化学发光反应产生的发射光进行探测。

球形芯片：多路复用蛋白质分析技术的第二种子技术采用了一种微球装置悬浮液，每个装置代表了一种不同的分析试验。

该系统有时被称为液体芯片。

通过荧光染料对这种微球（直径约5微米的塑料小球）进行内部编码，并分别用于多路复用分析的具体试验。

通过流式荧光分光光度法对小球进行检测。

对微球悬浮液进行自身免疫多路复用分析通常采用Luminex 公司（美国德州，Austin ）开发的技术。

通过该公司的xMAP 技术，经荧光团编码的微球在不同的分析中起到条形码的作用。

6每个小球装置可以通过具有不同生物测定特异性的试剂进行包被，分析物由小球装置中的不同红光和近红外线荧光染料浓度确定。

这样就可以对样品中的特定分析物进行捕捉和检测（图2）。

分析仪通过一道激光束激活小球的内部染料（这种染料将微球分为不同类别），而另一道激光则激活报告染料（通常是B-藻红蛋白），测定过程中该激发光将被捕捉。

各小球装置可以获得几十个到几百个读数。

Luminex 100流式设备通过数字信号处理技术按照预先设定的分布区域对各个微球进行分类。

每个微球表面都含有多个羧基，这些羧基可以作为蛋白质共价连接的位点。

通过一系列校准品对小球表面的报告染料进行定量测定。

微球具有较小的体积和较大的表面积，比平面固相芯片具有更好的反应动力学性能。

而且，微球在悬浮液中的流动性也优于静态平板芯片。

将样品均匀分布到所有平板芯片区域极为关键，但是对于悬浮芯片这一点却无关紧要。

目前已有多篇利用Luminex 技术进行自身免疫研究的研究报道。

其中一个试验同时检测了5种可提取性核自身抗原，与公认的单一试验ELISA 法相比具有良好的相关性。

另一个小组研究了37名干燥综合症患者血清中的抗核抗原(ANAs)和可提取性核抗原。

他们分别在84%和76%的患者血清中检测到干燥综合症A 抗原和B 抗原(SSA 和SSB)的抗体。

Bio-Rad Laboratories 公司(美国加州，Hercules)的BioPlex 2200 ANA 筛查仪是一种以Luminex 为基础的全自动系统，可以同时测定13种自身免疫抗体的水平。

一项临床研究表明，这种ANA 筛查仪的特异性与ELISA ANA 筛查试验不相上下。

与ELISA 试验相似，该BioPlex 系统的阳性率低于用于自身抗体筛查的间接免疫荧光试验。

优点和缺点：这两种多路复用技术（悬浮和平板芯片）各有优缺。

二维微芯片技术在蛋白质或核酸的高密度筛查（包括100多种的试验）方面非常出色。

平板芯片尤其适用于单一试验中对从细菌到人的各种生物体的整个基因组或蛋白质组进行同时分析。

微球芯片在临床试验室中的优势尤为突出，这些试验中的检测分析物都是精心设定而且通过较小的面板进行测定。

微芯片技术有时缺乏高通量临床应用所必需的重复性。

这主要是因为平板芯片的制备需要序列化的生产过程。

相反，微球芯片的大量生产具有平板芯片不易达到的分析重复性。

此外，平板芯片的超静定性和统计检验水平也不如微球芯片。

这是因为每个测定装置在一次多路复用小球反应中通常会检测数百个微球，每个小球代表一种不同的免疫测定，而且在计算结果前即可将数据集中的异常值排除在外。

悬浮芯片有助于根据客户要求将配合基与每个小球装置进行偶合。

结合在不同小球装置上的配合基可以在不同结合化学性质 图2. Luminex 系统中5 x 5红色/橙色25球芯片的小球分布图。

在这张液相球形芯片分布图上，每个小球装置带有不同含量的红光和/或红外线荧光染料，以此对具有各种不同荧光特征的小球进行区分。

和反应条件下进行反应。

每种配合基的纯度可能各不相同，例如有的像细胞裂解液一样，而有的像重组蛋白一样。

每个小球装置与配合基之间可以使用不同的接头。

最后，在每个小球装置制造时可以采用不同的包被后或封闭步骤。

微球芯片具有显著的优势：每个微球装置均以最佳方式单独加工，随后将不同的小球装置组合起来制备最终的多路复用小球试剂。

芯片检测中可以容纳大量的分析物，因此可以使用多个内部对照以确保测定系统的预期性能。

自身抗体的多路复用分析中可能需要不同的对照（表II ）。

相对荧光是芯片技术中常用的输出信号。

可以使用荧光内部标准（独立小球装置或芯片位点）对所有测定信号进行标准化。

这种标准化弥补了照明和检测系统的波动。

还可以根据相应的临床标本类型及和加样容积设计自身免疫测定中的其他内部检测。

这些内部对照是每个多路测定试验必须具有的功能。

多路复用检测中还可以考虑使用对一种分析物或一类分析物具有特异性的其他内部对照。

例如，通过类风湿因子(RF)内部测定可以检测RF 对IgM 自身抗体分析的潜在干扰。

检测总IgG 将有助于确保IgG 高丙种球蛋白标本不会由于竞争性抑制而干扰IgM 分析。