收稿日期:2003-07-16基金项目:国家863计划(2002AA 245011)和福建省科技厅重大科技项目(2002N 004)资助.作者简介:李今煜(1976-),女.研究方向:微生物分子生物学.*通讯作者.苏云金芽孢杆菌发酵培养基的筛选李今煜,陈　聪,关　雄*(福建农林大学生物农药中心,福建福州350002)摘要:采用正交试验对Bt W B 7菌株发酵培养基进行筛选,结果表明,不同原料对发酵液菌数影响相差较大,其中酵母粉和鱼粉影响最大.本试验获得的最佳摇瓶发酵配方为:玉米粉4%、黄豆饼粉1%、酵母粉2%、鱼粉 2.5%和蛋白胨0.1%(质量分数).关键词:苏云金芽孢杆菌;正交试验;发酵培养基中图分类号:Q 939.97文献标识码:A文章编号:1006-7817(2003)04-0490-03Screen of fermentative medium for Bacillus thuringiensisLI Jin-yu,C HEN Cong,GU AN Xiong(Biocide Research Center ,Fujia n Ag riculture and Fo restry Univ ersity,Fuzhou,Fuj ian 350002,China )Abstract :An orthog onal desig n was used to screen fer mentativ e medium of Bacillus thuringiensis iso late W B 7.Among these tests,yeast pow der and fish meal were the mo st efficient subst rates for Bt .The most a ppropriate fermenta tiv e medium is compo sed o f co rn meal 4%,soy bean flour 1%,y east po wder 2%,fish m eal 2.5%,peptone 0.1%.Key words :Bacillus thuringiensis ;or thog onal des ig n;fermentative medium苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,Bt )培养基配方与发酵水平密切相关[1],决定着产品的杀虫效果和企业的经济效益.近年来,一些研究人员相继采用正交设计的方法对培养基组分和培养条件进行优化筛选,取得了一定的成效[2].本试验室保存的WB 7菌株不仅具有较高的杀虫活性,而且含有丰富的基因资源,具有良好的开发前景和研究价值.目前我室已研究的有cry 、vip 和几丁质酶基因.因此,本文以农副产品为主要原料,采用正交试验的方法对该菌株进行发酵培养基的优化,确定适合于摇瓶培养的最佳配方.1　材料与方法1.1　供试材料1.1.1　菌种　Bt WB 7菌株为本室保存的菌株.1.1.2　培养基和原料　斜面及平板记数用LB 培养基[牛肉膏1%、蛋白胨1%、琼脂2%、NaCl 0.2%(质量分数)],灭菌前pH7.2.摇瓶发酵培养基原料由浦城绿安生物农药厂提供,其中黄豆饼粉由南昌汇通药业辅料有限公司生产,玉米粉由山东巨能电力集团金玉米开发有限公司生产,蛋白胨由仙游东风化工肥料厂生产,酵母粉由江门甘蔗化工厂生产,鱼粉购自浦城.上述原料使用时均过80目筛.1.2　试验方法1.2.1　正交试验设计　选择对Bt 生长和发育影响较大的玉米粉、黄豆饼粉、酵母粉、鱼粉和蛋白胨等5个培养基组分因素,根据前人的试验数据[3-7],每个因素设定3个水平,同时考虑玉米粉和黄豆饼粉、玉米粉和酵母粉的相互作用.采用L 18(37)正交表,随机安排因素和配比水平(表1).1.2.2　摇瓶培养　按正交试验设计表分别配制培养基,其它原料均为KH 2PO 40.2%、Ca CO 30.5%(质量分数)、p H 7.5.使用250m L 三角瓶,每瓶装液25m L,灭菌后接种,接种量为1%(体积分数).30℃下,185r ·min-1福建农林大学学报(自然科学版)第32卷第4期J o urnal of Fujian Ag riculture and Forestry U niv ersity (Na tural Science Editio n)2003年12月DOI:10.13323/ k i .j.f af u(n at.sci .).2003.04.019　表1　L 18(37)正交试验因素水平表1)　Table 1　L 18(37)orthogonal experimen tal factor level s %　水平因素A B C D E 1 2.5 2.0 1.0 2.50.12 4.0 1.00.5 1.00.431.54.52.00.00.21)A.玉米粉;B.黄豆饼粉;C.酵母粉;D .鱼粉;E.蛋白胨.摇床振荡培养,定时取样涂片染色观察菌体长势及芽孢晶体形成情况.芽孢晶体脱落率达到30%时停止培养.1.2.3　发酵液的活芽孢数测定　用稀释平板记数法测定活芽孢数.2　结果与分析从表2的结果和表3的方差分析可以明显看出,酵母粉、鱼粉浓度对发酵液菌数有显著的影响;玉米粉和黄豆饼粉的交互作用、玉米粉和酵母粉的交互作用对其有一定的影响;而玉米粉、黄豆饼粉和蛋白胨对发酵液菌数的影响比较微弱.表2　L 18(37)正交试验设计和结果1)Table 2　L 18(37)orthogonal experimen tal design and results试验号因子A/%B /%A ×BC /%A ×CD /%E /%活菌数×109/(个·m L -1)11(2.5)1(2.0)11(1.0)11(2.5)1(0.1) 5.5021(2.5)2(1.0)22(0.5)22(1.0)2(0.4) 4.0031(2.5)3(4.5)33(2.0)33(0.0)3(0.2) 6.0042(4.0)1(2.0)12(0.5)23(0)3(0.2) 3.3952(4.0)2(1.0)23(2.0)31(2.5)1(0.1)7.8962(4.0)3(4.5)31(1.0)12(1.0)2(0.4) 5.0673(1.5)1(2.0)21(1.0)32(1.0)3(0.2) 4.8983(1.5)2(1.0)32(0.5)13(0.0)1(0.1) 3.0093(1.5)3(4.5)13(2.0)21(2.5)2(0.4)7.56101(2.5)1(2.0)33(2.0)22(1.0.0)1(0.1) 6.28111(2.5)2(1.0)11(1.0)33(0.0)2(0.4) 5.61121(2.5)3(4.5)22(0.5)11(2.5)3(0.2) 3.83132(4.0)1(2.0)23(2.0)13(0.0)2(0.4) 4.67142(4.0)2(1.0)31(1.0)21(2.5)3(0.2) 5.33152(4.0)3(4.5)12(0.5)32(1.0)1(0.1) 5.50163(1.5)1(2.0)32(0.5)31(2.5)2(0.4)37.80173(1.5)2(1.0)13(2.0)12(1.0)3(0.2) 6.28183(1.5)3(4.5)21(1.0)23(0.0)1(0.1) 4.00K 131.2228.5133.8430.3928.3433.8932.1792.57K 231.8432.1129.2823.530.5632.0130.68K 329.5131.9529.4538.6833.6726.6729.72均值1 5.203 4.752 5.640 5.065 4.723 5.648 5.362均值2 5.307 5.352 4.880 3.917 5.093 5.335 5.113均值3 4.918 5.325 4.908 6.447 5.612 4.445 4.953 R0.3890.6000.7602.5300.8891.2030.409　1) A.玉米粉;B.黄豆饼粉;C.酵母粉;D .鱼粉;E.蛋白胨.表3　L 18(37)正交试验方差分析结果1)Table 3　L 18(37)orthogonal experimen tal design and analys is 方差来源偏差平方和自由度平均偏差平方和F 值备注A 0.48520.243 1.63F 0.05(2,3)=9.55B 1.37920.690 4.62F 0.1(2,3)= 5.46A ×B 2.2272 1.114 6.21C 19.25729.62964.49A ×C 2.3892 1.1958.00D 4.6772 2.33815.66E0.50820.254 1.70误差0.44830.149总计31.37017　1) A.玉米粉;B.黄豆饼粉;C.酵母粉;D .鱼粉;E.蛋白胨.491第4期李今煜等:苏云金芽孢杆菌发酵培养基的筛选492福建农林大学学报(自然科学版)第32卷 玉米粉是培养基中的主要碳源,玉米粉含量增大,发酵液菌数也提高,但菌数随玉米粉含量的增大而增大的趋势并不明显.说明碳源在Bt生长中的作用虽然是必需的,但并不是最重要的.鱼粉是培养基中主要的氮源,鱼粉含量从0增加至 2.5%,发酵液菌数从 4.445×109个·m L-1增加至5.648×109个·m L-1,变化明显大于玉米粉.说明氮源对Bt发酵的促进作用大于碳源.酵母粉不仅是重要的氮源,而且含有丰富的维生素和某些氨基酸,其含量变化能大大影响发酵液菌数.酵母粉质量分数为0.5%、1%和2%时,发酵液菌数分别为39.17×109、5.065×109和 6.447×109个·m L-1.这不仅再次证明了氮源在发酵中的重要性,也说明维生素和氨基酸对发酵也有显著的促进作用.黄豆饼粉和蛋白胨也是氮源,但在含有鱼粉作氮源的培养基中,再加入它们并不会明显影响发酵液菌数.玉米粉和黄豆饼粉的交互作用、玉米粉和酵母粉的交互作用反映了碳源和氮源比例关系的变化.它们对发酵液菌数的影响也比较明显,说明Bt的正常生长和发育过程对碳源、氮源的比例也有较严格的要求.从试验结果和上述分析中可以看出,高菌数培养基的最佳配方为5号,其组分含量为A2B2C3D1E1,即玉米粉4%、黄豆饼粉1%、酵母粉2%、鱼粉 2.5%、蛋白胨0.1%,以及少量无机盐CaCO3.3　讨论苏云金杆菌对营养要求不太严格,在工业生产上,常常以农副产品为培养基的主要原料即可达到生产要求.但是,由于农副产品的成分比较复杂,不同的农副产品和它们之间的不同配比都会对菌株的生长发育和产毒能力产生显著影响[7-9].前人研究[3,4,9]和本研究都证明了氮源对发酵液活菌数的影响大于碳源的影响,而氮源以酵母粉和鱼粉的影响最大.但在本研究,酵母粉对发酵液活菌数的影响大于鱼粉,与一些报道有所不同[3-4],说明不同来源的同种原料,由于其营养成分有所不同,对菌株的产孢能力也有影响.本试验以发酵液菌数为唯一指标,没有结合考虑发酵时间.上述的最佳配方虽然有利于获得较高的菌数,却需要较长的发酵时间(70h).可能是因为含固量偏高,对菌株的呼吸代谢有一定的抑制作用,进而影响菌株的生长.实际生产中,发酵时间过长不仅会增加生产成本,降低经济效益,而且还可能带来菌种衰退变异的问题.因此,在下一阶段有关发酵条件的研究和中试中,更倾向于使用发酵时间较短、菌数略低的配方.参考文献:[1]吴继星,谢天健,陈在铒,等.苏云金杆菌85-10-6(5)发酵培养基的筛选[J].微生物学通报,1988,15(6):254-256.[2]陈月华,任改新,梁凤来,等.中国Bt 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