沈阳药科大学
硕士学位论文
诺西肤发酵工艺的研究
姓名:韩果红
专业:微生物与生化药学
导师:何建勇教授
二00四年五月
P24 诺西肚的定性与定量测定
2.2，2.1生物效价测定法
1.检定菌菌悬液的制备
加40一5Oml无菌水到培养好的枯草芽抱杆菌茄形瓶斜面上[枯草芽抱杆菌斜面培养基(%):蛋白陈1.0·NaCI0.5,牛肉膏0.5,琼脂粉1.5.,pH7.8(灭菌前)蒸馏水配制].用接种环刮下芽抱和菌体，摇匀，65℃水浴保温3Om加，杀死营养细胞，保留芽抱，即为检定菌菌悬液。
2.生测平板的制备
将生物检定培养基[生物检定培养基(%):牛肉膏0.3蛋白陈0.5,K2HPO4 0.3,琼脂粉1.5，
pH8.0-8.2(灭菌前)蒸馏水配制] 2OOml灭菌后自然冷却到50一60℃后，倒入20x3Ocm的生物检定盘中，自然凝固，作为生测平板的下层。
将生物检定培养基100ml灭菌后自然冷却到50一60℃，向培养基中加入一定量的检定菌(枯草芽抱杆菌)菌悬液，混匀，然后倒入检定盘内己凝固的下层培养基上，自然凝固。
3.点样
用无菌小镊子取中Sunll的无菌圆滤纸片，按一定规律摆放在上层培养基的表面。
每个待测样品应点样2一3个滤纸片，以其抑菌圈的平均值进行计算。
盘内同时摆放加有不同剂量诺西肤标准溶液(IO00u/m)l的圆滤纸片，每个剂量点2一3个滤纸片，以其抑菌圈的平均值进行计算。
每个纸片上的加样量不超过5ul。
4.培养
将点好样的检定盘倒置于4℃冰箱中扩散10小时左右，然后于37℃恒温箱中培养16一18小时，不同点样量的诺西肤在检定盘中产生的抑菌圈大小不同，根据标准品的剂量及相应抑菌圈直径之间的对应关系得标准曲线方程，根据样品的抑菌圈直径通过标准曲线方程计算出对应的效价。
P35 高产菌株选育方法的建立
由于出发菌株的产量极低，为了加快高产菌株的筛选进度，为以后的菌种选育打下基础，需要建立一种简便、快捷的菌种选育方法。
为此，用琼脂块初筛的方法进行试验。
将经过自然分离(或诱变)后在分离平板上生长好的单菌落先目测筛选，挑选菌落丰满抱子量大的菌株用牙签点种至准备好的琼脂块上，28℃保湿培养5一6天，待菌落长好后用扩散法测定各个琼脂块的抑菌活性，根据抑菌圈的大小初步确定菌株的生产能力，挑选抑菌圈大的菌株，再通过摇瓶液体复筛初步确定高产菌株。
因为诺西肤属于脂溶性抗生素，在检定培养基中的扩散速度较慢，加上出发菌株的产量较低，所以37℃培养16一18小时后看不到抑菌圈。
为了解决这一问题，将待测活性的固体琼脂块在生测培养基上先扩散一段时间(4℃，12一16小时，该条件下对链霉菌本身无影响)，此时检定菌不能生长，诺西肤在此期间逐渐扩散到检定培养基中。
之后再将检定盘置于37℃培养16一18小时，则可以看到清晰的抑菌圈，从而建立了一种快速的高产菌株筛选方法(如图3一3所示)，并利用此方法挑选出了出发菌株YM4一2(发酵单位为61ou/ml)。
P39 3.6.1生物效价测定法
1 .检定菌(枯草芽袍杆菌)加入量的确定
进行生物效价测定时检定菌的加入量影响抑菌圈的大小(直径)，经过预试验发现当生测培养基上层加菌量为100一200uL/looml时，(1000u/ml)的诺西肤标准品形成的抑菌圈直径约为18一20mm
2 扩散时间的确定
由于诺西肽属于脂溶性抗生素，且分子量较大，因此在检定培养基中的扩散速度比较慢，如果点样后立即置于温箱中培养，会引起测定的结果偏低，因此用扩散法测定诺西肤的生物效价时，点样后必须先进行预扩散。
而且预扩散时间的长短也会引起测定结果的偏差。
通过试验最终确定了最适的预扩散时间为9~10小时。
那西肽产生菌特性的初步考察
（饲料与添加剂 2007 8：72-73）
枯草芽孢杆菌悬液制备方法
由甘油管传普通琼脂斜面, 37 ℃培养箱培养18 h,镜检芽孢在80%以上,在无菌条件下将菌体和芽孢刮下,移入装有适量无菌水的三角瓶后,置于60 ℃水浴中30 min,杀死菌体,得枯草芽孢杆菌悬液。
2. 4生物鉴定盘双层培养基制备方法
取生物鉴定盘,用酒精棉球消毒,置于超净台上,紫外灯照射20 min,倒入融化的生测培养基200 mL,待凝作为下层; 取枯草芽孢杆菌悬液100 μL 与100 mL生测培养基(约60 ℃)混匀,迅速倒入该生测鉴定盘中,注意使上层各处的厚度一致,表面平整,凝后备用
2.5效价测定方法
2．5．1发酵上清液效价测定法取5 mL发酵液离心(3 000 r /min, 25 min) ,测菌浓。
用微量进样器取上清液3μL点于定量滤纸片上,待干后,依序贴于铺好生测培养基的生物鉴定盘中,于4 ℃预培养12 h,后于37 ℃培养16～18 h。
用游标卡尺测量抑菌圈直径,记录。
2．5．2发酵液效价测定法取发酵液∶乙醇(95%) = 1∶1 (体积比)于离心管中, 37 ℃密闭抽提2 h (定时摇匀) ,用微量进样器取上层清液3μL点于定量滤纸片上,后同2. 5. 1。