中国热带医学2009年第9卷第10期CHINA TROPICAL M EDICINE Vol.9No.10October2009［论著］巴尔通体是一群革兰氏染色阴性、营养要求苛刻兼性细胞内寄生的需氧杆菌[1]，是一新发现的古老病原体，迄今已发现21种及3个亚种[2~5]。
作为新发及老传染病的病原体，从20世纪80年代开始再次肆虐人类，儿童和青年人发病较多，少数病人尤其是免疫力低下的病人如人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者可表现较为严重的并发症[6]。
因巴尔通体种类多，感染引起的疾病谱比较复杂，给人类健康带来巨大的威胁，日益引起国内外学者的关注。
大多数巴尔通体只在动物间传播，引起动物性疾病或菌血症。
1999年至今，已有大量的资料表明巴尔通体普遍存在于鼠群中[7~10]。
巴尔通体感染的实验室诊断方法主要依赖于血清学分析，临床标本培养既困难又低效，平均需要21d才能获得结果。
聚合酶链式反应也常被采用，主要依赖于DNA片段（如16s rRNA、gltA基因、16S23S ITS、rpoB基因和ribC基因）等的扩增[11~15]。
近年来，荧光实时定量PCR技术作为一种新型的PCR 技术备受重视。
本文以SYBR Green为荧光染料，扩增巴尔通体种属特异基因379bp枸橼酸合酶gltA，建立巴尔通体荧光实时定量PCR检测方法，用于鼠血中巴尔通体检测。
1材料与方法1.1材料1.1.1PCR扩增仪Mastercycler ep realplex荧光定量PCR仪（Eppendorf.Germany）.1.1.2试剂RealMasterMix（SYBR Green）和血液基因组DNA 提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司，兔血脑心浸液琼脂平板（Brain Heart Inf usion Agar，BD）。
1.1.3PCR采用的是具有巴尔通体属水平特异性的引物（BhCS781.p-BhCS1137.n,由上海生物工程研究所合成）,上游引物BhCS781.p硷基序列为:5'-GGG GACCAG CTC ATG GTG G-3',下游引物BhCS1137.n硷基序列为:5'-AAT GCA AAA AGA ACA GTA AAC A-3',对枸橼酸合酶基因（gltA）的379bp片断进行扩增。
1.1.4样品鼠全血来自厦门各区207份，宁德53份，漳州49份，合计309份。
于捕鼠当日在实验室以乙醚将动物麻醉后,对其种类、性别进行鉴定、编号、记录,经2%碘伏消毒皮肤,无菌器械剖取股动脉全血0.5～1ml于1.8ml螺口冻存管中置液氮（-巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法的建立姚美琳，罗炜，李国伟，苏丽琼，叶曦摘要：目的建立灵敏、特异的SYBR-Green荧光定量PCR检测巴尔通体的方法，以用于巴尔通体的实验室快速诊断和自然疫源地的流行病学研究。
方法利用离心柱法抽提鼠血中巴尔通体细菌基因组DNA，在荧光定量PCR 检测仪上检测基因组中枸橼酸合酶gltA的Ct含量，结合熔解曲线的Tm值进行分析，建立实时荧光定量检测法。
结果检测62份阳性菌株，Ct值小于30，Tm值在81-83℃范围内；检测309份鼠血抽提的基因组DNA样品，阳性128份，阳性率为38.19%。
结论建立了检测巴尔通体枸橼酸合酶gltA的SYBR-Green荧光定量PCR方法，较常规培养法更快捷、简便、敏感，适合大面积调查巴尔通体在鼠群中的分布情况，为流行病学的深入研究提供科学依据,并可作为检测巴尔通体的技术储备。
关键词：巴尔通体；SYBR-Green；荧光定量PCR中图分类号：R446.6文献标识码：A文章编号：1009-9727（2009）10-1963-03Establishment and application of real-time fluorescence quantitative PCR assay for detection of Bartonella.YAO Mei-lin，LUO Wei，LI Guo-wei，et al.（Haichang District Center for Disease Control and Prevention，Xiamen361026，Fujian，P.R.China）Abstract:Objective To develop a sensitive and specific quantitative SYBR-Green fluorescent PCR assay for rapid diagnosis of Bartonella and its natural foci.Methods Bartonella genomic DNA was extracted from rat blood by means of centrifuge column method.Real-time fluorescent quantitative assay was developed based on analysis of the Ct content of citrate synthase gltA combined with the value of Tm of melting curve by using the fluorescence quantitative PCR detection detector.Results There62positive strains were detected，Ct value was less than30and Tm values in the range of81-83℃;309genomic DNA were extracted from rat blood，128were positive with a positive rate of38.19%.Conclusion Real-time PCR are faster，more convenient，and sensitive for diagnosis of Bartonella infections，compared with traditional culture.This methods may be suitable for large-area survey of the distributioin of Bartonella in rat population，which will be usful for the epidemiological in-depth study of Bartonella.Key words:Bartonella；SYBR-Green Fluorescence quantitative PCR*作者单位：厦门市海沧区疾病预防控制中心，福建厦门361026作者简介：姚美琳（1967~），副主任技师，主要从事卫生微生物检验1963CHINA TROPICAL M EDICINE Vol.9No.10October2009中国热带医学2009年第9卷第10期196℃）中运送检，-70℃保存待检。
1.2方法1.2.1离心柱法提取全血中细菌基因组DNA取200μL鼠全血至1.5ml离心管中，添加500μl CL裂解液颠倒混匀10次后8000rpm1min,弃上清液；加入180μl20mg/ml的溶菌酶37℃处理30min以上；添加20μl蛋白酶K混匀15s；添加200μl GB 混匀至无团块物质，56℃水浴10min,期间颠倒混匀1~2次；添加200μl无水酒精颠倒10次混匀。
核酸吸附：将上述得到的溶液和沉淀物转移至吸附板柱CB3（套放在收集管中），12000rpm 30s，弃废液。
漂洗：添加500μl缓冲液GD12000rpm30s，弃废液；添加700μL漂洗液PW12000rpm30s，弃废液；添加500μl 漂洗液PW12000rpm30s，弃废液；12000rpm3min空甩去除乙醇。
核酸收集：将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，加入60μl洗脱缓冲液TB，室温放置2~5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
1.2.2加热法提取阳性菌株DNA刮取阳性菌落[10]5~10个于灭菌纯水中，置99℃孵育器加热50min，制成细菌基因组模板。
1.2.3引物配制合成引物浓度为100μM所需要加水量的计算公式为：加水量（μL）=摩尔数/102=质量/分子量×106/102=〔（OD 值×33）/（碱基数×324.5）〕×106/102需稀释为10μM使用。
1.2.4SYBR-Green荧光定量PCR扩增扩增反应总体积为20μl：RealMasterMix/SYBR solution9μl,引物上、下游各1μl，提取的细菌基因组DNA2μl，用纯水补足20μl。
在PCR扩增仪Mastercycler ep realplex上设定扩增条件为：95℃2min；95℃30s，48℃30s，70℃30s，40个循环；72℃5min;最后做熔解曲线分析。
2结果2.1gltA基因实时荧光定量PCR扩增将62份阳性菌株用加热法制成模板，上机行SYBR Green法进行PCR扩增，其扩增曲线均呈典型的指数扩增，最后到达平台，结果见图1。
图1巴尔通体gltA基因实时荧光定量PCR扩增曲线2.2gltA基因PCR扩增产物熔解曲线扩增产物的熔解曲线呈单峰状，见图2所示。
从熔解曲线可以看出，其Tm值范围在81-83℃之间，特异性强，可用于培养菌株的鉴定。
图2巴尔通体gltA基因实时荧光定量PCR扩增产物特异性熔解曲线2.3结果判断先看扩增曲线，其形态应为标准的扩增曲线，Ct值应小于30，Ct值与起始模板浓度成负相关关系，Ct值越小，模板含量越大。
再看熔解曲线，在81~83℃之间有尖锐的单峰，判断为阳性（见图3）；图3示非特异性扩增的熔解曲线，其中图3（A）为非特异和特异性扩增并存的熔解曲线，在78-80℃之间有一非特异扩增峰，图3（B）示单一非特异性扩增的熔解曲线，在77~78℃之间出现了宽而钝的单峰。
（A）巴尔通体gltA基因实时荧光定量PCR扩增产物特异性和非特异性并存的熔解曲线图3（B）巴尔通体gltA基因实时荧光定量PCR扩增产物非特异熔解曲线结合gltA基因扩增曲线和特异熔解曲线分析，309份鼠血标本直接抽提基因组DNA，经巴尔通体实时荧光PCR检测结果见表1。
表1鼠全血中细菌基因组gltA的荧光PCR检测结果3讨论枸橼酸合成酶（gltA）基因具有巴尔通体属特异性，它编码的46kDa的多肽与其它细菌的枸橼酸合成酶单体的分子量相符。