染色体G显带操作规程1.目的：规范细胞遗传（外周血）诊断的操作过程，以保证结果的准确、可靠。

2.应用范围：外周血细胞遗传标准实验操作及核型分析。

3.职责：3.1文件编写：实验室技术员。

3.2文件审核：科室负责人。

3.3文件审批：实验室主任。

3.4执行：细胞遗传室的所有工作人员。

4.内容：4.1实验原理：4.1.1．淋巴细胞的体外培养4.1.1.1．外周血（脐带血）中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。

当在培养基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。

4.1.1.2．离体培养的人体淋巴细胞的有丝分裂周期分为四个时期：DNA合成前期（G1期），约10～24h，为RNA和细胞质的合成；DNA合成期（S期）约为7h，在G1期的基础上，完成DNA的合成；DNA合成后期（G2期）约为4～6h，为后期RNA和细胞质的合成，活跃的RNA和微管蛋白等合成；细胞分裂期（M期）约为1.5h，又分为分裂前期、中期、后期和末期。

4.1.1.3．培养基分为天然培养基和人工培养基两种；实验室常用的外周血淋巴细胞培养基为二者的混合培养基，主要由RPMI1640和牛血清混合而成。

另外培养液中加有肝素钠用于防止血液的凝固，平衡盐溶液维持培养液的渗透压和pH，双抗（链霉素和青霉素）用于抑制细菌的生长等。

4.1.2．纺锤体的抑止4.1.2.1．在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。

因此，破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，不再粘附至细胞内任何结合力上，在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很容易铺展开来。

细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。

微管由微管蛋白组成，微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种，α微管蛋白和β微管蛋白彼此间具有很强的亲和力，常呈二聚体形式存在。

其中β微管蛋白肽链中第201位的半胱氨酸为秋水仙素与之结合的部位，秋水仙素与之结合后会引起微管解聚。

故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。

但是这一作用不影响染色体的复制和着丝粒的分裂，因此它可使分裂的细胞停留在中期，获得大量分裂相，以供分析之用。

4.1.2.2．秋水仙素（colchicum）是一种生物碱，因最初从百合科植物秋水仙（Colchicum autumnale）中取出来，故名。

分子式C22H25O6N，纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点157℃，易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。

味苦，有毒。

秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。

这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂（C-mitosis）。

在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而染色体加倍。

秋水仙素是一种三环结构化合物，第2和第3个环均是7元环。

它是甲基醚的类似物，包含4个甲氧基，1个乙酰化的初级氨基以及3个非苯型双键。

秋水仙素分子的第一个环上由三个甲氧基，这是作用活性不可缺少的反应基团；第二个环内的氨基被酯化，从而可增加其活性；第三个环的水合基团被甲基取代。

正因为如此，秋水仙素不仅易溶于水，而且即便所用的浓度极低，其反应活性仍很高。

4.1.3．低渗4.1.3.1．细胞经过秋水仙素处理后，尽管染色体已经比较适合观察了，但仍还不能满足要求，因为人类细胞的染色体数目多，形状小，最大的染色体约为7～8微米，加之主要的观察与分析均在油镜下进行，这就要求标本中的染色体彼此散开，并且尽可能处于同一平面上，这些均有赖于低渗处理。

覆盖在染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散，低渗液的渗透作用不仅可使粘附于染色体的核仁物质散开，清楚地显示每一个扭曲的染色体，而且还可以使细胞膨胀，染色体铺展。

4.1.3.2．低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。

可以是水，低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol／L）、氯化钾（0.075mol／L）、稀释的平衡盐溶液或培养基。

处理的时间一般为20～40min，处理时的温度为23～37℃。

早期研究中多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低渗液，也有些学者使用稀释的人血清。

自从1965年后，人们改用0.075mol／L的KCl作为低渗液，它可以使染色体的轮廓清楚，可染色性增强，染色时间缩短。

在相差显微镜下观察，KCl低渗处理标本的效果比其他低渗液更好，也适用于显微分光光度分析，当用显带染色时充分显示带型的特点。

4.1.4．固定4.1.4.1．固定是将组织细胞或其成分选择性地固定于某一特定阶段的过程，其目的是在杀死细胞的同时避免所研究成分受到破坏。

就细胞遗传学研究而言，固定的目的是在于提高染色体结构的可见性和显示染色体形态的细节，例如显示常染色质区和异染色质区，初级缢痕和次级缢痕等。

4.1.4.1.1．经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种不同的固定液（金属固定液或非金属固定液）予以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素从组织细胞上冲洗掉，否则，沉积在细胞表面的秋水仙素会影响染色体的形态，还会阻碍固定液穿透性。

为此，在低渗处理后，应尽早加入固定液进行预固定。

固定剂可迅速地穿透细胞，并将细胞瞬间杀死，使正在分裂的细胞立即阻留在各自特定的细胞周期时相上，否则原有的M期细胞的核分裂会继续下去，染色体松解为染色质，导致研究无法进行。

另外，预固定可使细胞都处于相同的固定微环境中，这样固定收获的细胞不会凝结在一起。

4.1.4.1.2．为使染色体结构不受破坏，提高染色体的可见性及染色体的嗜碱性，就需要是染色质物质沉淀。

在活体条件下，细胞内不同成分的折射系数之间相差较小，在显微镜下不能分辨出明显的染色体结构；随着核蛋白的凝结和沉淀，染色体的折射系数将会发生很大的变化，从而使它们在细胞内成为明显的小体。

因此迄今所用的固定剂都具有交联蛋白的特性，都能使染色质沉淀。

常用的染色体固定剂往往是数种化学物的混合物，其中至少有一种化学物必须具备这一特性。

4.1.4.1.3．随着细胞的死亡而出现的另一些变化（特别是蛋白质的自溶作用），往往会破坏染色体的原来结构。

在正常情况下，细胞内的酶参与蛋白质的合成，而当细胞死亡时，由于介质变为酸性，这些酶便在相反方向起作用，即使是复合蛋白质裂解为简单的氨基酸也是如此。

因为多肽是染色体的主要成分之一，所以，这种变性效应最终引起染色体结构的破坏。

因此，作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自溶作用。

此外，在细胞致死的同时，细菌的活动猖獗致使细胞内成分的分解。

因此一种好的固定剂当既能起到防腐作用，又能阻止这种分解作用。

4.1.4.1.4．理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果，即能增强染色体的嗜碱性。

显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些条件，因而通常是将数种可以共存的液体混合起来，使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。

尽管如此，哪怕是最佳的固定剂，仍难免有不足之处。

首先细胞被杀死后发生的一些变化很难予以避免；其次，可能会抽提出一些弥散成分，最后，即便是操作十分谨慎，仍难以保持酶活性不变。

此外，有一些化学物还会导致细胞的皱缩。

4.1.4.2．用作固定剂的化合物又可分为非金属的和金属的两大类。

前者如乙醇、甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等；后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀和醋酸镧等。

其中有几种化合物还可作为蒸汽固定剂（Vapour fixative），也即在接触水或其它溶剂之前使可溶性物质先转变为不溶性物质，这样就可以在原位制作标本。

另外，按照正在细胞内沉淀蛋白质的特性不同，又可把固定剂分成沉淀性和非沉淀性两种。

沉淀性固定剂如铬酸、氯化汞和乙醇等，非沉淀性固定剂如四氧化锇、重铬酸钾等。

4.1.4.2.1．醋酸是一种理想的染色体的固定剂，它能使核酸沉淀，使组蛋白溶解，但却不能固定细胞质蛋白。

在染色体结构的研究中，醋酸的主要用途是阻止染色体收缩，使染色体的结构免于破坏。

经醋酸固定的物质还能抵消乙醇的硬化作用。

它可使染色体结构保持完整，且多半不致破坏核蛋白。

这种固定剂的一个缺点是会导致染色体片段的过分膨胀，因此如果要研究染色体的详细结构，必须把它与乙醇或类似的化合物一道使用，后者能使组织收缩和硬化。

醋酸作为固定液中的一种成分具有以下优点：①可以与迄今所用的任何一种固定剂同时使用；②浓度可以很低或很高；③具有很强的穿透性能。

此外，醋酸还是苯胺类染料的一种优良溶剂。

因此它是染料和固定液混合物中必需的一种成分，例如醋酸-洋红、醋酸-奥辛和醋酸-间苯二酚蓝等4.1.4.2.2．甲醇是焦木酸的一种成分，从木材分解蒸馏制得，广泛地用于动物染色体的固定。

它可以使蛋白质沉淀，还具有脱水性，可使蛋白质出现不可逆转的变性，使组织硬化，但其不能有效地固定染色体，易被氧化剂氧化成甲酸，故不能与氧化剂共存。

甲酸是一种无色有毒的液体且可以任何比例与水混合。

4.1.4.2.3．乙醇的有效浓度与甲醇一样。

它和甲醇一样可以使蛋白质沉淀，还具有脱水性。

可使蛋白质出现不可逆转的变性，使组织硬化。

但是在有氧化剂存在时乙醇会很快被氧化为乙醛，并进而变成醋酸。

它最重要的优点是能够迅速地穿透人组织。

因此，乙醇也被广泛地用作染色体固定剂的一种成分。

乙醇不能与许多金属固定剂（铬酸或四氧化锇）相混用，否则会被氧化。

此外乙醇不能有效地固定染色质，原则上也不能与醋酸、甲醛或氯仿混合使用。

但是如果要对染色体的酶进行研究时，可以用80%冷乙醇固定1h 或更多时间；如用于单层培养物，往往以纯乙醇或95%的乙醇固定1～15min，因为酶的反应基团一般是不受乙醇破坏的。

4.1.4.2.4．1886年Carnoy首先用醋酸、乙醇混合作为固定剂，故名为卡诺固定液。

其特点是穿透快，且很利于染色体结构的研究。

目前常用的卡诺固定液是由1份冰醋酸和3份甲醇混合而成的。

所有的动植物和人类染色体的固定都可以用卡诺固定液，固定时间为15min至24h，温度为室温或稍冷。

随着醋酸比例的增高，固定液膨胀的效能加大，有利于染色体的铺展，因此必要时可以改变酸和醇的比例，例如改成1:2或1:4等，但是如果过度膨胀则会导致细胞破碎，反而不利于分析。

卡诺固定液中缺乏有助于染色体嗜碱性的金属成分，因此经这种方式固定的组织不能被许多碱性染料的水溶液染上色，除非使用一些特殊的媒染剂如铬酸。

4.1.5．制片4.1.5.1．固定完成后就进入制片阶段。

早期多采用涂片法、挤压法，后来很快被气干法取代，现今气干法在哺乳类和人类细胞遗传学中广泛应用。

4.1.5.2．涂片法（smear）：细胞是在固定之前就铺展到载玻片上的，而且无需什么处理便可使细胞分散开，整个操作迅速，很适于精细观察。

4.1.5.3．挤压法（squashing）：需要在固定或染色之后给以特殊的处理，然后放上盖玻片加压，如此方能从结实的细胞团块得到散开的细胞。