2020/8/9 养基，1ml吸管，培养皿
菌落总数测定
2020/8/9
倾注培养
2020/8/9
培养结果
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菌落总数测定
• 实验步骤 5.菌落计数： 肉眼观察，可用放大镜，可标记 必要时分区计数，菌落成片者作废
• 计算方法 某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值 选择菌落数在30-300之间的稀释度 （1）仅有一个稀释度在此范围： 菌落数×稀释倍数
5.解此方程，得x=MPN 6.该方程为超越方程，一般采用数值法求近似解 7.日常实验时采用查表法推算MPN值。 8.表格在教材第260-261页。
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x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数
2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管 数为Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生 的概率为：
n
其中C为常系数i1
Vi(
Pi eVix /V
1
Qi)
0
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MPN法原理
3.当y(x)max，XMPN 4.由于y(x)为单极值函数，令dy/dx=0,即
• 目的：对某种细菌进行选择性计数 • 核心思想：泊松分布 • 实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释
度分别接种若干培养管，根据阳性管数估 算MPN值
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MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method）
1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布: P(x=k)=e-x ×xk/k!
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液体接种
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复发酵
• 复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管 内有气体产生
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大肠菌群数测定
• 注意事项： 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种
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MPN法原理
• MPN法（Most Probable Number Method ）
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媒染
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脱色
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复染
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革兰染色法
革兰氏染色阴性
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n
C(PiQi)!/(Pi!Qi!) i1
革兰氏染色阳性
复发酵
• 器材与试剂 培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接
2020/8/9 种环、复发酵管
大肠菌群数测定
• 实验步骤 3.复发酵 （1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌 落1-3个 （2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 （3）培养：37℃，24h （4）观察指标：产酸，产气
革兰染色法
• 涂片：接种环，挑取菌落， 生理盐水一滴，涂匀
• 热固定：通过火焰若干次 • 初染：结晶紫一滴，1min，水洗 • 媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗 • 脱色：95%乙醇，30s或至无色为止 • 复染：复红一滴，30s
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涂片
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热固定
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初染
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分离培养
• 器材与试剂 初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平
2020/8/9 板培养基
分区划线法
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第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
分区划线法
• 操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40°角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条 线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平 板上滑动
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菌落总数测定
• 计算方法： （2）有两个稀释度在30-300之间 菌落数之比>2，选较小值 菌落数之比<2，取平均值 （3）所有稀释度均>300 取稀释倍数最大者 （4）所有稀释度均<30 取稀释倍数最小者 （5）没有任何稀释度在30-300之间 选最接近该范围者
• 结果单位：CFU/ml（g）
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初发酵结果
• 右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。
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• 实验步骤 3.复发酵 （1）选取产气试管 （2）接种至10mlBGLB肉汤中 （3）培养：36℃，48h （4）观察指标：若产气则报告大肠 菌群阳性。
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大肠菌群数测定
• 实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养： 36℃，48h
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大肠菌群数测定
• 实验步骤 2.分离培养：
（5）菌落特征： 深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深
（6）革兰染色、镜检：选特征菌落
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革兰染色法
• 器材与试剂 结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、
2020/8/9 生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸
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菌落总数测定
• 注意事项：
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1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识
大肠菌群数测定
• 实验目的 • 实验原理
36 ℃，48h，产气（小倒管） 三步法：初发酵、复发酵 • 器材与试剂 样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤 1ml吸管、10ml吸管、试管测定 • 大肠菌群测定 • MPN法原理（拓展内容）
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菌落总数测定
• 掌握菌落总数测定方法 • 实验原理
不同稀释度的样品，营养琼脂培养 基，36 ℃，48h（水产品30 ℃，72h ），菌落数
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菌落总数测定
• 器材与试剂： 样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培
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初发酵
• 器材与试剂 样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST肉
汤，单料LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球
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大肠菌群数测定
• 实验步骤： 1.初发酵
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吸取样品方法
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加注样品