菌落总数与大肠菌群数测定
MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method） 1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布: P(x=k)=e-x ×xk/k! x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数 2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为 Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为：
其中C为常系数
V为总水样量，x为细菌个数
MPN法原理
3.当y(x)max，XMPN 4.由于y(x)为单极值函数，令dy/dx=0,即
5.解此方程，得x=MPN 6.该方程为超越方程，一般采用数值法求近似解 7.日常实验时采用查表法推算MPN值。 8.表格在教材第260-261页。
Vi( e
菌落总数与大肠菌群数测定
主要内容
菌落总数测定 大肠菌群测定 MPN法原理（拓展内容）
菌落总数测定
掌握菌落总数测定方法 实验原理 不同稀释度的样品，营养琼脂培养基， 36 ℃，48h（水产品30 ℃，72h ），菌 落数
菌落总数测定
器材与试剂： 样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基， 1ml吸管，培养皿
i 1
n
Pi 1
Vix / V
Qi) 0
液体接种
复发酵
复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有 气体产生
大肠菌群数测定
注意事项： 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种
MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method） 目的：对某种细菌进行选择性计数 核心思想：泊松分布 实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分 别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值
菌落总数测定
注意事项： 1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识
大肠菌群数测定
实验目的 实验原理 36 ℃，48h，产气（小倒管） 三步法：初发酵、复发酵 器材与试剂 样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤 1ml吸管、10ml吸管、试管、小倒管
初发酵
器材与试剂 样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST 肉汤，单料LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球
ห้องสมุดไป่ตู้
大肠菌群数测定
实验步骤： 1.初发酵
吸取样品方法
加注样品
初发酵结果
右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。
实验步骤 3.复发酵 （1）选取产气试管 （2）接种至10mlBGLB肉汤中 （3）培养：36℃，48h （4）观察指标：若产气则报告大肠菌 群阳性。
大肠菌群数测定
实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养： 36℃，48h
分离培养
器材与试剂 初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰 平板培养基
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线
菌落总数测定
倾注培养
培养结果
菌落总数测定
实验步骤 5.菌落计数： 肉眼观察，可用放大镜，可标记 必要时分区计数，菌落成片者作废 计算方法 某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值 选择菌落数在30-300之间的稀释度 （1）仅有一个稀释度在此范围： 菌落数×稀释倍数
菌落总数测定
计算方法： （2）有两个稀释度在30-300之间 菌落数之比>2，选较小值 菌落数之比<2，取平均值 （3）所有稀释度均>300 取稀释倍数最大者 （4）所有稀释度均<30 取稀释倍数最小者 （5）没有任何稀释度在30-300之间 选最接近该范围者 结果单位：CFU/ml（g）
革兰染色法
器材与试剂 结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理 盐水、酒精灯、载玻片、滤纸
革兰染色法
涂片：接种环，挑取菌落， 生理盐水一滴，涂匀 热固定：通过火焰若干次 初染：结晶紫一滴，1min，水洗 媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗 脱色：95%乙醇，30s或至无色为止 复染：复红一滴，30s
灭菌接种环
分区划线法
操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40°角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上 滑动
大肠菌群数测定
实验步骤 2.分离培养：
（5）菌落特征： 深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深 （6）革兰染色、镜检：选特征菌落
涂片
热固定
初染
媒染
脱色
复染
革兰染色法
革兰氏染色阴性
革兰氏染色阳性
复发酵
器材与试剂 培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、 复发酵管
大肠菌群数测定
实验步骤 3.复发酵 （1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落 1-3个 （2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 （3）培养：37℃，24h （4）观察指标：产酸，产气
