植物叶绿体基因工程的研究进展植物细胞的遗传物质分别存在于细胞核和细胞器中。
以细胞核为外源基因受体的传统植物基因工程虽已发展趋于成熟并得到广泛运用，但仍存在一系列难以解决的问题：目的基因表达量不理想，同时转入多个基因时操作步骤过于复杂，所表达的原核基因必须经过修饰改造，因位置效应的影响需花费大量的精力筛选符合要求的转基因植株，环境安全难以保证等。
叶绿体转化系统的出现为克服这些困难带来了希望[1]。
叶绿体基因工程是以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作, 通过一定方法使外源基因穿过细胞膜和叶绿体双层膜进入叶绿体, 在同源重组片段的介导下与叶绿体基因组之间发生同源重组, 以定点整合方式进入叶绿体基因组, 在其中转录、翻译并获得终产物的技术。
叶绿体基因组是120~160kb的裸露双链闭合环状DNA，通常由一对反向重复序列和大单拷贝区、小单拷贝区组成，以多拷贝形式存在，内部碱基分布不均匀，GC 含量为25%~38%，功能相关的基因多以“多顺反子”形式存在（刘良式，1998）[1]。
仅于二十多年前人们才提出叶绿体作为外源基因受体的可能性，但由于此新转化系统可超量表达目的基因，消除位置效应，并能有效防止目的基因对周围环境的污染，因而自问世以来迅速在多个领域表现出旺盛的生命力，现已成功表达了抗虫基因，抗除草剂基因，并已生产出具生物活性的人类生长激素蛋白。
1.叶绿体基因工程的建立及发展1.1 叶绿体基因工程的建立为减轻目的基因大量表达对植物造成的危害，叶绿体很早已成为外源基因产物的储存场所。
通过在目的基因5'端加上受体植物内源的导肽序列，利用核转化就可将基因的产物定位于叶绿体。
但这种方法首先要合成前体蛋白，然后在导肽的引导下穿过双层膜进入叶绿体，所经环节较多，且受核转化系统自身缺点的限制，因而人们一直在寻找一种更为合适的表达系统。
1987年，Klein等人人建立了基因枪转化方法。
1988年Boynoton等首次用野生型叶绿体DNA转化了单细胞生物衣藻突变体（atPB基因突变体），使其完全恢复光合作用能力，标志着叶绿体基因工程的诞生。
1990年外源基因首次于高等植物叶绿体中获的瞬间表达（Daniell et all,1990）[2]。
Y e等（1990）又对所创建的轰击转化系统进行改进，建立了一种较为有效的叶绿体转化方法[2]。
1.2 叶绿体基因工程的发展及应用叶绿体作为植物细胞光合作用中心以及转化受体所具备的特点必将使其成为植物基因工程的一个十分重要的研究领域，其研究内容相当广泛。
1.2.1 利用叶绿体转基因植物表达疫苗的研究叶绿体转基因植物生产的疫苗保持了重组蛋白的理化特性和生物活性,有的不经提纯就能作为一种可食疫苗(edible vaccine)口服使用，这样对于疫苗的运输和推广极为有利。
利用叶绿体转基因植物表达疫苗的研究包括范国昌等（1999），张中林等（1999），山松等（2000）对肝炎病毒抗原的研究。
Daniell等(2001)对霍乱病毒蛋白B抗原的研究。
Daniell 等（2004）对鼠疫疫苗抗原的研究。
Tregoning 等（2003）对破伤风(tetanus)病毒的研究，这项工作为利用植物生产安全的破伤风口服疫苗奠定了基础。
Sun 等(2003）对口蹄疫(foot-andmouth disease,FMD)病毒抗原的研究，这项工作为运用衣藻叶绿体作为生物反应器, 表达动物黏膜免疫疫苗提供了一条可行性途径。
Watson 等(2004)，Koya等(2005)对炭疽抗原的研究。
Molina等(2004, 2005)对犬细小病毒抗原的研究证实转基因植物的叶片提取物能够使鼠和兔产生抗体, 这是通过叶绿体基因工程表达动物疫苗的首例报道。
1.2.2 利用叶绿体转基因植物表达药用蛋白的研究多数药用蛋白的四维结构对其生物学活性至关重要。
叶绿体基因工程生产的生物大分子可具有正确空间构象, 这为利用叶绿体转基因植物商业化生产药用蛋白奠定了基础。
Staub等(2000)对人生长激素（somatotropin）的研究；Leelavathi和Reddy(2003)对干扰素(interferon)的研究；Fernandez-San等（2003）对人血清蛋白（(human serum albumin, HSA）的研究；Daniell 等（2004)对胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF-1)的研究；Daniell和Dhingra（2002）对单克隆抗体的研究；Guo等（2004）对水蛭素（hirudin）的研究[3]。
1.2.3 利用叶绿体转基因植物表达其他重要物质的研究利用叶绿体作为生物反应器, 除合成蛋白类物质外, 还可用于合成生物可降解塑料、脂肪酸、氨基酸及糖类等物质。
这些物质的合成, 主要是通过向叶绿体内导入该物质合成过程关键酶的编码基因, 通过增加酶的含量而达到增加合成产物的目的。
张景昱等（2002）对生物可降解塑料的研究对于解决“白色污染”问题有着重要的意义；Madoka 等（2002），Zhang等（2001）对脂肪酸和氨基酸的研究；Lee等（2003）对海藻糖（trehalose）的研究让我们看到了通过叶绿体基因工程调控碳水化合物代谢的新希望。
2.叶绿体基因工程概述2.1叶绿体简介叶绿体是绿色植物光合作用的场所，来源于古代的衣藻类原核生物，含有双链环状DNA （Manning,1971)。
叶绿体DNA有IRA和IRB两个反向重复序列（分别位于A链和B链），两者基因大小完全相同，只是方向相反，它们之间有一个大的单拷贝区（large single copy region.,LSC),大小约80kb，和一个小的单拷贝区（small single copy region,SSC),大小约20kb[3]。
大多数叶绿体DNA大小在120~160kb，最大2000kb（伞藻），最小85kb(刺海松）。
叶绿体基因多为多顺反子转录单位这些转录单位中基因排列顺序是高度保守的。
2.2 叶绿体转化的特点及优点叶绿体基因具有分子量小，结构简单，便于遗传的特点，故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因，这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数。
叶绿体基因可实现外源基因的定点整合，避免位置效应和基因沉默；遗传表达具有原核性；安全性好，叶绿体属于母系遗传，后代材料稳定；目的基因产物对植物的影响小。
叶绿体转化的最大优点是外源基因的高效表达。
这是因为叶绿体基因本身就有巨大的拷贝数（5000~10000拷贝/细胞）[4]，下表列出了几种外源基因在叶绿体转化和核转化中的表达丰度的比较：转基因植物的安全性是植物基因工程的一个很重要的问题。
不仅从理论上，实践中也有许多实例证明了这种情况确实存在，而且主要是通过花粉传播的，这将很大程度上限制转基因植物的实际应用。
叶绿体转化可以避免这种情况发生，因为绝大多数高等植物的叶绿体是母本遗传的，花粉中不存在外源基因。
叶绿体基因工程是以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作, 通过一定方法使外源基因穿过细胞膜和叶绿体双层膜进入叶绿体, 在同源重组片段的介导下与叶绿体基因组之间发生同源重组, 以定点整合方式进入叶绿体基因组, 在其中转录、翻译并获得终产物的技术。
其优越性在于他对外源基因的高效表达，基因的原核表达形式，无位置效应和基因沉默现象，环境安全性好，基因产物对植物的影响小等方面。
2.3叶绿体转化的主要过程及方法叶绿体转化过程通常分4步：一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体；二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里；三是筛选具有转化的叶绿体细胞；四是继代繁殖得道稳定的叶绿体转化植物[6]。
依据叶绿体转化的主要过程，生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法，其中常用的叶绿体转化方法主要有基因枪法（(biolistics），农杆菌介导法(V enkateswarlu and Nazar,1991)，PEG法（galinstan expansion femesyringe）（Kofer et al,1998），显微注射法（Schnorf et al,1994），玻璃珠法（Kindle et al,1991），点击法（Rao et al,1995）等[7]。
基因枪法（(biolistics）是目前采用最多、转化效率最高的方法，基因枪法耗时少，程序简单而且经同源重组整合到叶绿体的外源基因表达水平高。
PEG法可以扩大DNA缺刻，常用来将具有生物活性的DNA导入植物核基因组，也特别适合应用在叶绿体转化上，因为经过PEG处理的完整原生质体中的叶绿体双层膜也被PEG作用，虽然作用机理尚未明晰，但是这种方法仍然是一种可靠而稳定的转质体基因技术。
农杆菌T-DNA介导的遗传转化法。
将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的Ti 质粒上，然后通过与植物组织或器官共培养，最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达[7]。
3.叶绿体基因工程存在的问题3.1 叶绿体基因转化在杂合体上的稳定性问题由于高等植物的每个细胞中有10~100个叶绿体[2][8]，每个叶绿体内有10~100个叶绿体基因组拷贝，因此转化的叶绿体和未转化的野生叶绿体同时存在于转基因植株中，造成这种杂合体在遗传上是不稳定的。
在转化外源基因之前，目前可采用降低叶绿体拷贝数、高压筛选和选用致死突变体作为外源基因的受体等方法使转基因植株易于同化。
3.2 植物的种类有待扩展可能是由于大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚，因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。
目前，已成功转化的植物种类很少，只有番茄和烟草通过有性生殖使外源基因获得稳定遗传，而番茄却是唯一能有高的外源蛋白积累的可食用果实的植物。
3.3 去除选择标记基因的方法有待优化目前用于植物叶绿体转化的选择标记主要为aadA基因[9], 它提供壮观霉素或链霉素抗性。
筛选标记可能会使动物或人体产生抗药性, 而且筛选标记基因的高表达对于植物也是一个很大的代谢负担。
因此, 有必要研究和开发去除叶绿体转基因植物中标记基因的方法。
有几个研究组已经在做这方面的尝试。
第一种消除叶绿体标记基因的方法是通过正向重复序列将其去除(loop out)(Iamtham and Day, 2000)[12],但由于转化和目标基因的消除同时发生, 所以这个系统很难控制。
2001 年有2 个研究小组将P1 噬菌体CRE-loxP位点特异重组系统引入到消除叶绿体标记基因的工作中(Corneille et al., 2001;Hajdukiewicz et al., 2001)[13]。
根据CRE-loxP 方案, 标记基因两侧设有34 bp 正向loxP 位点与目的基因一起被导入叶绿体基因组, Cre则通过农杆菌介导转化被导入到核基因组, 随后再通过叶绿体信号肽进入到叶绿体中。