2.1 目的基因的分离和鉴定
◆ 对已知序列进行分子克隆
PCR扩增 扩增
◆与已知基因紧密连锁基因的分离
◆ 根据植株或细胞表型变异进行基因分离
转座子导入细胞 野生型 细胞核 DNA
转座子标签法
目的形状突变NA同源的序列 同源的序列 加入与植物中特定 为了实现将目的基因和植物基因组有效整合， 为了实现将目的基因和植物基因组有效整合，植物基因 工程中常在目的基因两端接上能和植物特定基因能整合的 DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方 序列，一方面可以提高外源基因的插入效率； 序列 面也可以结合植物基因组表达调控规律， 面也可以结合植物基因组表达调控规律，通过调整所加同 源序列的碱基序列有效地控制外源基因的插入位点和表达 时间，使目的基因更便于操作以及整合后更好地发挥作用。 时间，使目的基因更便于操作以及整合后更好地发挥作用。 加入报道基因 常用的报道基因： 常用的报道基因：lacZ、ocs、cat、nptⅡ、lux和gus 、 、 、 Ⅱ 和
第六章 植物抗病基因工程的基本 原理与方法
植物抗病基因工程是通过分子生物学技术获得对植物病 病毒、细菌、真菌、线虫等病害） 害（病毒、细菌、真菌、线虫等病害）具有一定抗性的转基 因植株。 因植株。
► 1983年首例转基因烟草问世。 年首例转基因烟草问世。 年首例转基因烟草问世 ► 1994年首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花等获得批准 年首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花等获得批准
2.4 转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定 ◆ 植物外植体经过农杆菌或 植物外植体经过农杆菌或DNA直接转化后，大部分 直接转化后， 直接转化后
细胞是没有转化的，只有极少数是转化的， 细胞是没有转化的，只有极少数是转化的，这就需要采用 特定的的方式将未转化细胞与转化细胞区分开来， 特定的的方式将未转化细胞与转化细胞区分开来，淘汰未 转化的细胞， 转化的细胞，然后利用植物细胞的全能性在适宜的环境条 件下使转化的细胞再生成可育的转基因植株。 件下使转化的细胞再生成可育的转基因植株。
加入翻译起始密码子 由于植物中mRNA的翻译起始密码子多数也是 的翻译起始密码子多数也是AUG， 由于植物中 的翻译起始密码子多数也是 ， 因此， 因此，要在目的基因功能蛋白的编码序列前加上适当的 核苷酸序列。 核苷酸序列。 加入终止密码子 植物基因工程中所使用的mRNA翻译终止密码子有 翻译终止密码子有 植物基因工程中所使用的 UAA、UAG、UGA三种。一般在目的基因功能蛋白的 三种。 、 、 三种 编码序列后直接加上对应的碱基序列。 编码序列后直接加上对应的碱基序列。实验中通常采用 的是Ti质粒中的 质粒中的Nos终止子。 终止子。 的是 质粒中的 终止子 加入增强序列
加入转录的加尾序列 真核生物为保证一个结构基因表达完全末端需要有 一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止； 一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止；另一 方面保证形成有活性的mRNA链。植物基因工程中常 方面保证形成有活性的 链 用的加尾序列是AATAAA。 用的加尾序列是 。 插入内含子 内含子是真核生物基因组结构的特点之一。 内含子是真核生物基因组结构的特点之一。在基因 工程中， 工程中，多数不用在目的基因中插入这种片段就能得到 有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。 有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。 但是在实际操作中， 但是在实际操作中，如果在目的基因适当的位置插入这 种序列，其表达量可以提高几十到几百倍。因此， 种序列，其表达量可以提高几十到几百倍。因此，有人 推测，内含子可能在基因翻译中起增强子的作用。 推测，内含子可能子基因
◆ H. Anzai(1989),et al.分离到了抗烟毒素（tabtoxin） 分离到了抗烟毒素（ 分离到了抗烟毒素 ） 的基因ttr，将基因ttr与 的基因 ，将基因 与CaMV 35S启动子融合成嵌合基 启动子融合成嵌合基 通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获得ttr高表达 因，通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获得 高表达 量的转基因植株， 量的转基因植株，对烟毒素和病原菌的侵染均表现出良 好的抗性。 好的抗性。 ◆ 菜豆毒素（phaseolotoxin）是一种非寄主专化性毒 菜豆毒素（ ） 产菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通过 菌株通过argK基因 素，产菜豆毒素的 菌株通过 基因 合成一种不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，从而对该毒 合成一种不被菜豆毒素抑制的 酶 素不敏感。 基因导入烟草和菜豆， 素不敏感。将argK基因导入烟草和菜豆，获得的转基因 基因导入烟草和菜豆 烟草和菜豆对P.s.pv.phaseolicola有较高的抗性。 有较高的抗性。 烟草和菜豆对 有较高的抗性
►目前，已经商品化的转基因作物所转入的外源基因主要是抗性基 目前，
因，只有少数是改良作物品种性状的。 只有少数是改良作物品种性状的。
1 植物抗病基因工程策略
1.1 导入植物抗病相关基因和病原菌致病相关基因 在植物抗性基因的利用方面 根据已有的R基因结构特征 设计新的R基因 基因结构特征， 基因。 ◆ 根据已有的 基因结构特征，设计新的 基因。 ◆ 异源表达 基因。 异源表达R基因 基因。 向同一株植物中导入多个R基因 基因。 ◆ 向同一株植物中导入多个 基因。 在病原菌无毒基因的利用方面 转病原菌无毒基因。 ◇ 转病原菌无毒基因。 将病原菌无毒基因和相应的R基因一起导入植物 基因一起导入植物。 ◇ 将病原菌无毒基因和相应的 基因一起导入植物。 导入与植物抗病信号有关的基因。 ◇ 导入与植物抗病信号有关的基因。
第七章 转基因作物及其外源 抗性基因检测技术
概况
世界上已批准 进行商品化转基因 作物：大豆、玉米、棉花、 西红柿、马铃薯、甜椒、 作物：大豆、玉米、棉花、 西红柿、马铃薯、甜椒、西 葫芦、木瓜、甜菜、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜等， 葫芦、木瓜、甜菜、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜等，其中 前四种超过了99％，种植面积最大的是转基因大豆，种植 前四种超过了 ％，种植面积最大的是转基因大豆， ％，种植面积最大的是转基因大豆 面积为3650万公顷，占62％，其次是转基因玉米，种植面 万公顷， ％，其次是转基因玉米 面积为 万公顷 ％，其次是转基因玉米， 积为1240万公顷，占21％，第三是转基因棉花，种植面积 万公顷， ％，第三是转基因棉花 积为 万公顷 ％，第三是转基因棉花， 万公顷， ％，第四是转基因油菜 为680万公顷，占12％，第四是转基因油菜，种植面积 万公顷 ％，第四是转基因油菜，种植面积300 万公顷， 万公顷，占5％。 ％。
进行商品化生产。目前，国内外已报道的转基因作物有 种 多个品系 多个品系。 进行商品化生产。目前，国内外已报道的转基因作物有1 6种70多个品系。
►自1986年3月以后，我国已研究的转基因作物 类，涉及的转基因 月以后， 年 月以后 我国已研究的转基因作物47类
103种。正式公布的转基因作物：棉花、大豆、西红柿、青椒和矮牵牛。 种 正式公布的转基因作物：棉花、大豆、西红柿、青椒和矮牵牛。
2 植物抗病基因工程的技术环节
◆ 至今已分离的供植物基因工程应用的目的
基因有100多个，其中研究得比较多的是抗病毒、 多个，其中研究得比较多的是抗病毒、 基因有 多个 细菌和真菌的基因， 细菌和真菌的基因，能杀死害虫或使害虫拒食的 基因，能抵抗各种除草剂的基因，能抗逆境如干 基因，能抵抗各种除草剂的基因， 高寒、高温盐碱等的基因， 旱、高寒、高温盐碱等的基因，能提高植物体中 蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。 蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。这些基因 中有些是来自植物本身，有些来自微生物， 中有些是来自植物本身，有些来自微生物，还有 少数是人工合成的。 少数是人工合成的。
◆ 目前，转化细胞与非转化细胞的区分及非转化细胞 目前，
的淘汰常采用抗菌素抗性基因及抗除草剂基因， 的淘汰常采用抗菌素抗性基因及抗除草剂基因，总称筛选 标记。植物基因工程中常用的筛选标记是nptⅡ 标记。植物基因工程中常用的筛选标记是 Ⅱ（neomycin phosphotransferase）基因和 （chloramphenicol acetyltr）基因和cat（ ansferase ）基因
基因挽救技术 基因组相减法 cDNA差式显示 差式显示
用转座子序列
完整的目的 性状基因 转座子标签法流程图
2.2 表达载体的构建
◆ 目的基因分离后，往往需要经过修饰才能应用于 目的基因分离后， 植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的5’ 植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的 端加上启动子，在基因的3’端加上中止子 端加上中止子， 端加上启动子，在基因的 端加上中止子，以便使外源 基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。 基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。 加入启动子区 目前植物基因工程中外源基因常选用的启动子主要 质粒的T-DNA序列上分离的启动 有3类：第一类是从 质粒的 类 第一类是从Ti质粒的 序列上分离的启动 具有真核生物转基因起始所需的TATA盒和 盒和CAT盒； 区。具有真核生物转基因起始所需的 盒和 盒 第二类是CaMV的35S和19S启动子；第三类是从植物 启动子； 第二类是 的 和 启动子 本身分离出来的启动子。 本身分离出来的启动子。
2.3 目的基因向植物的转化
◆ 近年来，植物的遗传转化技术得到了迅 近年来， 速的发展，已建立了多种转化系统， 速的发展，已建立了多种转化系统，如以农杆 质粒及Ri质粒为载体的转化系统 菌Ti质粒及 质粒为载体的转化系统，以PEG 质粒及 质粒为载体的转化系统， 介导的原生质化学导入法、电激法、基因枪法、 介导的原生质化学导入法、电激法、基因枪法、 花管导入法等等。总之， 花管导入法等等。总之，植物细胞遗传转化系 统可分为两大类： 统可分为两大类：以载体为介导的基因转化 （vector mediated gene transfer）和DNA直接 ） 直接 转化（ 转化（naked DNA transfer）。 ）。