Protein expression
检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达，并确定在不同IPTG浓度和时间蛋白诱导 效率的差异。 挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜
（8-16h）。 37C，1mM IPTG终浓度诱导蛋白。取700ul过夜摇菌加入7ml含有相应抗生素LB培
外源基因在原核寄主细胞中表达, 它的编码结构 必须是连续的, 不间断的, 处于寄主启动子有效 控制下。
启动子
可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件 1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10% - 30%以上 2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平 3 ) 应该是诱导型的, 能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。 常用的大肠杆菌表达载体启动子：
An introduction to liquid chromatography
Protein solution applied to a column
Column = solid porous matrix (stationary phase) + liquid (mobile phase)
β－半乳糖苷酶基因lacZ 荧光素酶基因 (luciferase )基因、 半乳糖激酶基因(galK ) 氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因 (cat ) 四环素抗性基因 (tetr ) Tag-
保护碱基 内切酶1 目的基因 内切酶2 保护碱基
X gene
引物的设计：设计一对特异性 引物。上游、下游引物引入酶 切位点
c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。
d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。
e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸 的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强
转译起始序列
Yeast
Mammalian Insect
Expression System Characteristics
Characteristics
doubling time cost of growth medium expression level protein folding
N-linked glycos.
Fractional precipitation of proteins
Precipitate contaminants
Add Precipitant, Centrifugation
Precipitate protein of interest
Discard pellet
Add Precipitant, Centrifugation, Discard supernatant, Resuspend protein
λ噬菌体的PL启动子 大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子 色氨酸操纵子trp启动子 pBR322质粒的beta－内酰胺酶启动子
终止子
a: 如果在克隆基因编码区的3末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够 阻止转录通读过位于下游另一个启动子
b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子 , 那么由该启动子驱 动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。
养液的50ml离心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接种，37C培养时，细菌生长至 OD600＝0.4-0.6约需2h）时加入终浓度为1mM的IPTG。 诱导前在37C培养的菌液中取1ml未诱导的对照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例 (如1ml OD600为0.4的菌加40ul buffer)加入2×上样缓冲液，混匀，-20℃保存或直接 上样。 根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS-PAGE胶。（50KD蛋白10％或12％） 诱导3-4h后收集菌液，取1ml样品，测OD600，10000rpm，1min离心去上清后加入 相应体积的2×上样缓冲液，vortex。 将收集的菌液在水中煮5min，上样10μl ，120V电压走浓缩胶，加电压至150V进入 分离胶电泳，直到染料刚好走到胶底。 取下胶，考马斯亮蓝染色至少30min（染液若是新配的，染20min就够了），脱色液 脱色。若急需看到结果，可以将胶在500ml蒸馏水中煮沸两次即可看到条带。
IPTG induction
1. Even in the absence of IPTG, there is some expression of T7 RNA polymerase from the lacUV5 promoter.
2. The degree of toxicity will vary from protein to protein.
Protein isolation, concentration, and stabilization
Reversible precipitation with salt or
organic molecules
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)
Vector
二 大肠杆菌表达载体的基本组成
一个良好的大肠杆菌表达载体： 复制起点(ori) 多克隆位点。 筛选标记（抗菌素抗性基因、Tag、筛选标记） 控制和调节转录与翻译的必不可少的原件
X基因
内切酶1 目的基因
+
内切酶2 保护碱基
R1
R2
Your destination vector
Your linearized vector
1：DNA marker; 2：重组质粒pET28-X双酶切; 3：空质粒pET28a双酶切
图图1.14.X3 基重但因组为发质同生粒义点pE突突T变2变8（-(XAS双GerU酶）→切A鉴G定C)，
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression
Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。 追踪某些特定的DNA结构 (重组质粒 )是否已经导 入寄主细胞 同任何一种目的启动子连接 , 其表达活性可作为 检测启动子功能的依据。
O-linked glycos. phosphorylation acetylation acylation g-carboxylation project cost
E. coli
rapid (30 min) low
high refolding may be
required no
no no no no no low
Yeast
rapid (90 min) low
low – high refolding may be required high mannose
yes yes yes yes no low
Insect
slow (18-24 hrs) high
low – high proper folding
simple, no sialic acid yes yes yes yes no
图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
图1.6 X蛋白表达条件：诱导时间优化
Protein Purification
Characterize function, activity, structure Use in assays Raise antibodies many other reasons ...
蛋白表达、纯化
抗体制备应用及ELISA间接法
卢士强 2010-11-18
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA 2. 表达宿主 3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cell-free
Bacterial
Adapted from: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
Basic scheme of protein purification
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC