第一章蛋白表达纯化
一、诱导表达分析
1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜;
2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜;
3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时;
4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。
二、蛋白纯化
2.1重组蛋白的提取
2.1.1 提取缓冲液
20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。
如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。
Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。
2.1.2 方法
1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30
minutes at +4 °C)。
2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬；
3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。
4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。
5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分
析。
Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。
还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。
6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。
7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:含有8 M urea的样品可以直接电泳上样，但含有6 M guanidine hydrochloride的样品必须换成8 M urea才可上样。
8)样品上样前必须完全溶解并用稀释或换液的方法调整缓冲液。
9)如样品暂时不使用应存于-20 °C。
融合蛋白
2.2 Ni柱纯化(His)
6
1)缓冲液：
a、S tart buffer: 0.02 M sodium phospate, 0.5 M NaCl 5-50 mM imidazole pH
7.4
b、Elution buffer: 0.02 M sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole
pH 7.4
Note: 如recombinant (His)6-tagged protein 表达成包涵体还需加入6 M guanidine hydrochloride or 8 M urea 。
2)层析柱准备：用Start buffer平衡10柱体积
3)样品纯化：
a. 用start buffer平衡5-10柱体积；
b. 上样；
c. 用start buffer洗涤5-10柱体积；
d. 用Elute buffer洗脱10-20柱体积；
4)层析柱清洗(CIP)：2 M NaCl反向清洗0.5个柱体积，洗15分钟；1 M NaOH 以
1ml/mim反向洗40min。
2.3 GST柱纯化GST融合蛋白
1) 缓冲液：
a.Start buffer: PBS pH 7.4
b. Elution buffer: 50mM Tris HCl，10mM reduced glutathione pH 8.0
2) 样品纯化：
a.用start buffer平衡5-10柱体积；
b.上样；
c.用start buffer洗涤5-10柱体积；
d.用Elute buffer洗脱10-20柱体积；
3) 层析柱清洗(CIP)：6 M guanidine hydrochloride清洗2个柱体积。
2.4 离子交换层析(IEC)
1) 缓冲液：
a、S tart buffer: See Table 1
b、Elution buffer: Start buffer + 1 M NaCl
Table 1. Suggested buffer for various pH intervals
2) 样品准备：样品需用脱盐柱换成start buffer。
3) 样品纯化：
a、用start buffer以1 ml/min洗涤5ml；
b、用elution buffer以1 ml/min洗涤5ml；
c、用start buffer 5 - 10 ml平衡层析柱；
d、上样；
e、用start buffer 5 - 10 ml洗涤层析柱；
f、用elution buffer以0-100%的阶段或连续梯度洗脱20ml以上。
4) 层析柱清洗(CIP)：
2 M NaCl以1ml/mim反向清洗10个柱体积；1 M NaOH 以1ml/mim反向洗40min。
2.5 凝胶过滤(GF)
Separation range (Mr)
<10 000 (Superdex 30 pg)
3 000–70 000 (Superdex 75 pg)
10 000–600 000 (Superdex 200 pg)
Column volume 319–330 ml
Sample volume Up to 13 ml
Recommended flow rate 2.5ml/min
Max. flow rate 4.25ml/min
Maximum pressure 0.5 MPa, 5 bar, 73 psi
pH stability
long term and working range 3–12
short term 1–14
Solutions in which the media is stable
1 M acetic acid
1 M sodium hydroxide
8 M urea
6 M guanidine hydrochloride
30% isopropanol
30% acetonitrile
70% ethanol
Storage
20% ethanol
1) 缓冲液：
根据需要使用相应的缓冲体系。
通常为了减少非特异性吸附缓冲液一般需加入至少0.15 M NaCl。
PBS(pH7.4)是常用的缓冲液。
2) 层析柱准备：上样前用2柱体积elution buffer平衡。
3) 层析柱清洗(CIP)：0.5 M NaOH以0.5ml/min反向清洗1-2 hours 。
三、蛋白浓度测定（Bradford法）
1、取7根试管，按表1进行配比
2、配比后，室温下静置5min后，以0号管为对照，测定OD595。
以BSA 含量为横坐标，对应的吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
3、待测蛋白质浓度的样品，取其适量（以不超过标准曲线范围为限），用0.15mMNaCl补加体积至100ul，测定OD595。
根据标准曲线，计算出相应的蛋白质含量。
表1：Bradford法测定蛋白质浓度
Table 1:Protein concentration assay by Bradford method
0 1 2 3 4 5 6
1mg/mlBSA(ul) 0 10 20 40 60 80 100
0.15mMNaCl(ul) 100 90 80 60 40 20 0
Bradford工作液(ml) 5 5 5 5 5 5 5。