几株石油烃降解菌的研究易力;押辉远;李迪;张祥胜【摘要】对从胜利油田的石油污染土壤中分离出的5株细菌进行降油能力的初步评价发现,石油烃降解率分别为48.7％、43.2％、38.2％、51.4％和39.4％；对这5株菌通过形态特征和生理生化特征进行分类学鉴定发现,5种菌分别属于假单胞菌属、红球菌属、芽孢杆菌、放线菌属和微球菌属.最后研究了这5株菌在不同盐度和pH条件下的生长状况,为石油烃降解菌的应用提供了依据.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2011(038)006【总页数】3页(P165-167)【关键词】石油污染土壤;生物修复;石油烃降解菌【作者】易力;押辉远;李迪;张祥胜【作者单位】洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;山东大学微生物技术国家重点实验室,山东济南250100【正文语种】中文【中图分类】X131.3随着石油工业的发展，石油在开采、运输和使用过程中的泄漏以及含油废弃物排放引起的土壤污染问题日益严重，石油污染土壤的修复技术研究日益受到人们的重视。
在诸多石油污染土壤的治理方法中，生物修复由于具有经济、有效以及对环境破坏性小等优点而被认为具有广阔的应用前景[1]。
石油污染土壤的生物修复，是指利用微生物及其他生物将存在于土壤、地下水和海洋中的有毒有害的石油污染物现场降解成CO2和H2O或转化为无害物质的工程技术系统[2]。
分离筛选对石油具有较强降解能力的菌株，是研究细菌降解石油的机理及对污染水域或土壤进行生物修复的基础。
本研究对从胜利油田的石油污染土壤和油泥沙中分离和筛选出的降解石油烃的微生物进行降解石油烃评价，对筛选出的高效石油烃降解菌株进行鉴定，根据形态特征和生理生化特征进行分类学鉴定，并研究其最适生长条件，以期为生物修复石油污染土壤提供菌种资源，并为降解石油烃微生物的生长提供最佳条件。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验仪器 QYC-2102大容量双层全温摇床（上海新苗医疗器械制造有限公司）、奥特光学BK5000生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）、SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、FA2104A电子天平（上海精天电子仪器有限公司）、LD2X-40KB立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、SPX-250BS-Ⅱ生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、PHS-25（数显）pH计（上海精密科学仪器有限公司）、UV-1100S紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。
1.1.2 菌株 5株分解石油的微生物分离自山东胜利油田石油污染土壤，编号为A、B、C、E、G。
菌株由长江大学生命科学学院提供。
1.1.3 试剂草酸铵结晶紫染液；路哥尔氏碘液；95%乙醇；0.5%沙黄染液。
1.1.4 培养基（1）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 15 g，琼脂 15～20 g，蒸馏水 1 L，pH 7.2～7.4。
（2）LB 培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母膏 10 g，NaCl 15 g，蒸馏水 1 L，pH 7.2。
（3）无机盐培养基：大量元素液：MgSO4·7H2O 0.40 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，KH2PO41.00 g，K2HPO41.00 g，NH4NO31.00 g，FeCl30.05 g，酵母膏 1.00 g，微量元素液2 mL，蒸馏水 1 L，pH 7.2；微量元素液：MnSO460 mg，ZnSO4·7H2O 200 mg，蒸馏水 1 L。
（4）降油培养基：无机盐培养基+5%原油，pH值7.2。
（5）淀粉水解培养基（淀粉水解用）；葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验用）；西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（柠檬酸盐利用实验用）；生化反应管（吲哚试验、尿素分解、明胶液化、七叶灵水解、硫化氢分解、葡萄糖利用、乳糖利用、蔗糖利用）。
1.2 试验方法1.2.1 石油降解率的测定在150 mL液体无机盐培养基中接种石油降解菌，接种量为培养液体积的0.5%。
并加入 5%原油，经摇床培养（28℃，120 r/min）后，加入 20 mL石油醚于30℃～60℃萃取，并将培养液置于5 000 r/min下离心10 min，转至分液漏斗，振荡100次，静置，待分层后分离，收集上层液，用石油醚洗涤2～3次，合并上层液，在烤箱中65℃蒸干，冷却后称重[3]。
除油率的计算采用下列公式：除油率=（m3－m2）/m1×100%式中，m1为最初的含油量，m2为降解后的残余油量，m3为对照组的残余油量。
1.2.2 菌株形态特征根据各株细菌的降油能力大小，筛选出降油能力高的菌株进行研究。
选择合适的稀释度将菌液涂布在固体牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃条件下培养24 h，观察菌落大小和菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色[4]。
1.2.3 菌株的生理生化鉴定采用穿刺接种法观察细菌运动性。
参考崔丽虹等[5]所列的生理生化鉴定项目，根据《常见细菌系统鉴定手册》[6]和《微生物学实验教程》[4]中的试验方法进行测定。
1.2.4 耐盐测试牛肉膏蛋白胨液体培养基培养细菌，调节培养液中NaCl的质量分数为1%、2%、5%、8%、10%，28℃条件下培养24 h。
将菌液稀释5倍后测量菌液在540 nm时的OD值。
1.2.5 耐酸碱测试牛肉膏蛋白胨液体培养基培养细菌，调节培养液 pH 值为 4.0、6.5、7.5、9.0、10.0，28℃条件下培养24 h。
将菌液稀释5倍后测量菌液在540 nm时的OD值。
2 结果与分析2.1 各菌株降油能力比较试验结果表明，供试菌株石油烃降解率均大于35%，菌株 A、B、C、E、G 的降解率分别为 48.7%、43.2%、38.3%、51.4%、39.4%。
采用重量法测定菌株的降油率，在石油的萃取和样品称量过程中不可避免地会产生误差。
但本试验的目的在于筛选出高效降解石油烃的菌株，因此该试验结果有一定的参考价值，对石油烃降解率高的菌株筛选有意义。
2.2 各菌株形态特征和生理生化特征比较各菌株形态特征和生理生化特征鉴定结果见表1。
通过一系列生理生化测试结果对菌株进行对比鉴定，确定菌株A为假单胞菌属，菌株B为红球菌属，菌株C为芽孢杆菌属，菌株E为放线菌属，菌株G为微球菌属。
2.3 盐度对各菌株生长的影响外界环境渗透压的不同会导致微生物原生质膜上的离子种类和数量出现变化，从而影响其生长和繁殖，此外也有可能是过多的Na+抑制了微生物脱氢酶和氧化酶的分泌，影响石油烃的降解率。
因此，本试验设定不同的盐度值，考查其对不同菌株的影响，结果见表2。
由表2可知，菌株A可以在高浓度盐下生长；菌株B和菌株C在低盐浓度下生长良好，但不能适应高盐环境；菌株E适应范围较广，但随着盐浓度增加，生长呈下降趋势；菌株G在低盐浓度下生长状况良好，但不适应高盐环境。
表1 各菌株形态特征和生理生化特征比较注：“+”表示产酸或产气“-”表示不产酸或不产气。
菌株指标菌落形态菌落颜色菌体形态革兰氏染色运动性接触酶试验氧化酶试验吲哚试验尿素酶试验M.R试验V.P试验淀粉水解试验明胶液化试验七叶灵水解试验硫化氢分解试验柠檬酸盐利用试验葡萄糖发酵试验乳糖发酵试验蔗糖发酵试验A B C E G圆形浅黄杆状G-圆形浅黄短杆G+圆形白色短杆G+圆形浅黄短杆G+圆形浅黄球状G++++-+++-++-+++-++--+--+------+++---+--+--++-+-+---+--+-+---+-++-++--+---+--表2 各菌株在不同盐度下培养的光密度值（30℃）菌株不同NaCl浓度的光密度值ABCEG 1%0.063 0.168 0.167 0.114 0.263 2%0.106 0.107 0.148 0.1200.175 5%0.046 0.039 0.105 0.082 0.054 8%0.158 0.015 0.035 0.068 0.082 10%0.140 0.010 0.027 0.031 0.0082.4 酸碱度对各菌株生长的影响环境pH值变化对微生物的生命活动影响很大，主要表现为引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收；影响代谢中酶的活性，从而改变生长环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性。
因此，本试验设定不同的酸碱度，考查其对不同菌株的影响。
结果（表3）表明，菌株A对酸碱性的适应范围较广，且可以在高pH值下生长；菌株B在低pH下难以生长，但在pH高于6.5的培养液中生长较好；菌株C、和菌株E的酸碱性适应范围广；菌株G在中性条件下生长状况良好，但不适应极端pH环境。
表3 各菌株在不同pH值下培养的光密度值（30℃）不同pH的光密度值菌株ABCEG 4.0 0.145 0.014 0.083 0.087 0.018 6.5 0.154 0.108 0.182 0.128 0.500 7.5 0.117 0.119 0.183 0.123 0.127 9.0 0.080 0.163 0.134 0.147 0.114 10.00.269 0.136 0.221 0.078 0.1623 结论与讨论3.1 据统计，迄今为止发现能降解石油的微生物有200种以上[7]。
有关石油及其产品的微生物降解方面的研究常有报道，土壤中最主要的降解细菌有假单胞菌属（Pseudomonas）、无色杆菌属（Achramobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、节杆菌属（Archrobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、黄杆菌属（Flavobacterium）、棒杆菌属（Coryneforms）、微杆菌属（Microbacterium）、微球菌属（Micrococcus）、放线菌属（Actinomycetes）、诺卡氏菌属（Nocardia）、分枝杆菌属（Mycobacterium）等[8]。
在大多数土壤环境中，上述细菌是主要的石油降解菌，其中最常见的是假单胞菌，其对短链及长链烷烃、芳烃均能降解，而且能使烷烃彻底降解。
这些微生物广泛分布于土壤和水体中，尤其是受石油污染的环境中。
在本试验中，5株高效石油烃降油率的菌株分别为假单胞菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、放线菌属和微球菌属。
3.2 很多研究的筛选方法通常都是在土著微生物中进行，并采用现场石油污染的土壤进行降解率检测，存在驯化及筛选时间长、定量不够精确等问题。
本试验从已知的可降解的菌落中筛选菌种，并采用定量模拟石油污染土壤进行降解率检测，时间短、准确性高，且可筛选出高效菌种。