柴油高效降解菌株筛选及降解特性研究 岳贵龙;陈亮;刘娜 【摘 要】采用梯度富集培养、稀释涂布从受石油污染的样品中,分离得到柴油降解菌株10株,其中菌株YR2柴油降解率最高,在含柴油1％(w/v)的无机盐液体培养基中培养7d,降解率达到92.8％,在2％、4％、5％的柴油浓度下降解率分别为60.8％、53.5％、41.0％.综合菌株形态特征观察、生理生化特性分析和16S rDNA序列比对,菌株YR2应为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa).菌株YR2具有较好的细胞表面疏水性、乳化性能和排油性能.薄层层析结果表明菌株YR2分泌糖脂类表面活性剂.菌株YR2具有高效的柴油降解能力,有望应用于柴油污染的微生物修复.

【期刊名称】《生物技术通报》 【年(卷),期】2014(000)001 【总页数】5页(P161-165) 【关键词】柴油;假单胞菌;糖脂;细胞表面疏水性;微生物降解 【作 者】岳贵龙;陈亮;刘娜 【作者单位】河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001

【正文语种】中 文 柴油污染对土壤和水体环境威胁巨大，具有致癌、致畸、致突变等危害，直接影响到生态系统平衡和人体健康。常规物理化学方法处理柴油污染物，能耗和处理成本高，易对环境造成二次污染。而采用微生物降解的方法处理柴油污染物具有明显的优势［1］。 国内外已有研究证明柴油污染微生物修复技术的基础和关键是筛选高效的柴油降解微生物。但是，目前柴油降解菌株大多是在柴油浓度1%或者更低浓度下分离筛选得到的［2-5］，而实际污染物中柴油浓度远远高于1%。低浓度柴油下筛选得到的降解菌株在实际应用中柴油降解效果欠佳。 本文从受石油污染的样品中通过梯度富集培养分离筛选高浓度柴油降解菌株，并对降解菌株的乳化性能、排油性能和细胞表面疏水性进行研究，以期为柴油污染微生物修复提供菌株和参考。 1.1 材料 1.1.1 样品 中原油田、南阳油田、普光油气田等 地受石油污染土壤以及油基钻屑。 1.1.2 培养基 无机盐液体培养基：NH4NO32 g，K2HPO41.5 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，无水氯化钙 0.01 g，Na2EDTA·2H2O 0.01 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2-7.4。 油平板培养基：无机盐液体培养基1 000 mL，柴油10 mL，琼脂18 g。 牛肉膏蛋白胨固体培养基［6］（NA培养基）。 1.2 方法 1.2.1 梯度富集培养 取样品10 g加入到100 mL含柴油1%（w/v）的无机盐液体培养基中，于30℃、170 r/min富集培养5 d后，以5%的接种量接入到柴油浓度2%的无机盐液体培养基继续富集培养5 d，然后依次转入到柴油浓度3%、4%、5%的无机盐液体培养基进行富集培养。取培养液在固体油平板上进行稀释涂布，挑取生长迅速的菌落进行划线分离纯化，保存备用。 1.2.2 柴油降解率测定 将菌株活化培养液以5%（v/v）的接种量接入不同柴油浓度的无机盐液体培养基中，于30℃、170 r/min下培养7 d后，采用重量法［7］测定柴油降解率，以不接菌的培养液作为空白对照，每个试验重复3次。降解率计算公式如下： 降解率（%）=W0-W1/W0×100% W0是对照组残油质量（g），W1是试验组残油质量（g）。 1.2.3 柴油降解菌株鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》［8］进行菌株形态特征观察和生理生化特性分析。菌株形态特征观察包括菌落形态观察、结晶紫染色、革兰氏染色，生理生化特性分析包括需氧性试验、葡萄糖发酵试验、运动性试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、甲基红试验、V-P试验、吲哚试验等。 菌株16S rDNA序列比对参照文献［9］进行。使用细菌基因组提取试剂盒（北京鼎国）提取菌株基因组DNA，以细菌16S rDNA扩增通用引物27F和1492R进行PCR扩增，PCR产物经电泳检测后送样测序。 1.2.4 菌株降解特性 1.2.4.1 乳化性能 菌株于柴油无机盐液体培养基培养5 d后，于12 000 r/min离心20 min，收集发酵上清液，于带刻度试管中加入等体积的发酵上清液和柴油，充分振荡5 min后静置24 h，观察并记录乳化层高度和稳定性，计算乳化指数（EI）［10］。以未接种的培养液作为空白对照。 1.2.4.2 排油性能 发酵液排油性能以排油圈直径计，采用排油圈法［10］测定。 1.2.4.3 表面活性物质分析 发酵液表面活性物质分析采用薄层层析法。将等体积的发酵上清液和萃取液（氯仿∶甲醇=2∶1）混合，充分振荡后取样进行薄层层析，展开后用苯酚硫酸试剂显色。 1.2.4.4 菌体细胞表面疏水性 细胞表面疏水性以细胞表面疏水率计，测定采用Rosenberg测定方法的改进方法［11］。菌株于柴油无机盐液体培养基培养5 d，离心后重悬于灭菌的无机盐液体培养基中，取悬浮液1.5 mL调节OD600至0.5，加入200 μL柴油涡旋3 min，静置待水相和油相分层后，记录悬浮液OD600的变化。以无机盐液体培养基为空白对照，每个试验重复3次。细胞表面疏水率计算公式如下： 细胞表面疏水率（%）=（1-Ac/A0）×100% Ac和A0分别是振荡后悬浮液的吸光值和振荡前悬浮液的吸光值。 2.1 柴油降解菌株筛选 经富集培养后分离纯化得到能以柴油作为唯一碳源的细菌10株，其中菌株YR2降解效果最好。分别在柴油浓度1%、2%、4%、5%的无机盐液体培养基培养7 d后，降解率分别为92.8%、60.8%、53.5%、41.0%。 2.2 菌株鉴定 如图1所示，菌株YR2在NA平板上菌落黄色微绿、不透明，菌落表面有褶皱、边缘裂纹，产黄 绿色色素；细胞短杆状，单个或成对出现，革兰氏阴性，无芽孢；菌株YR2需氧生长，利用葡萄糖产酸不产气，运动性、氧化酶试验、硝酸盐还原为阳性，甲基红试验、V-P试验、吲哚试验为阴性，菌株YR2生理生化特性与铜绿假单胞菌基本保持一致。 菌株YR2的16S rDNA序列（GeneBank登录号KF530279）经BLAST比对，发现与Pseudomonas aeruginosastrain S25（DQ095913） 和Pseudomonas aeruginosastrain D1（KF113578）的同源性均为99%，构建Neighbor-Joining系统发育树如图2所示。 综合菌株形态特征观察、生理生化特性分析和16S rDNA序列比对，菌株YR2为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。 2.3 菌株降解特性 2.3.1 乳化性能 如图3所示，菌株发酵液对等体积柴油的乳化效果明显，乳化指数高达75%，且静置24 h后乳化层仍然稳定，表明菌株YR2在生长代谢过程中分泌高效表面活性物质，有效增加了菌株菌体细胞与烃类物质的接触面积。 2.3.2 发酵液排油性能 向油膜中心滴加培养5 d后的发酵液，经测定排油圈直径为7.7 cm，表明菌株在发酵液中分泌有高效表面活性物质。 2.3.3 表面活性物质定性分析 薄层层析展开后经苯酚硫酸试剂显色，出现糖脂类物质的棕色斑点，Rf值0.67，与鼠李糖脂标准品Rf值接近，由此可初步判断菌株产糖脂类表面活性剂。 2.3.4 细胞表面疏水性 菌株YR2在柴油浓度为2%、4%、5%的无机盐液体培养基中培养5 d，细胞表面疏水率分别为54.1%、54.3%、66.4%，说明菌株具有良好的细胞表面疏水性。 图4所示为菌株YR2细胞与油滴微粒的黏附现象。取菌株发酵液与美兰染液混合后于光学显微镜下进行观察，发现在油滴微粒周围吸附有大量的菌体细胞（菌体细胞蓝色、较小，油滴透明、较大）， 即在菌株分泌的表面活性物质作用下，疏水性油滴被分散为微粒进入水相，进而形成了油滴-菌体细胞-水的混合体系。 菌株YR2柴油降解能力明显高于国内外相关报道，详见表1。由表1可知，国内外目前关于柴油降解微生物菌株的研究大多在低浓度柴油（1%）下进行。高浓度柴油会对微生物细胞产生明显毒害作用以及形成的油膜会阻隔菌体细胞与外界环境的物质运输，导致微生物菌株不能良好地生长。本研究采用梯度富集培养筛选柴油降解菌株，提高了菌株对高浓度柴油的适应性。 菌株YR2在柴油浓度2%、4%、5%条件下，细胞表面疏水率分别为54.1%、54.3%、66.4%。即随着柴油浓度的升高，菌株YR2的细胞表面疏水率也随之升高，也说明菌株细胞经过富集培养后对于高浓度柴油具有较好的适应性。 现有研究显示，疏水性的烃类化合物由于其本身具有较高疏水性、固液分配系数，影响其与细菌细胞的黏附，只能通过非特定扩散机理并在疏水性最高的区域进入细胞内［16］。而良好的菌株细胞表面疏水性可以促进菌体细胞、疏水性油滴微粒的充分黏附，从而促进菌体细胞对烃类物质的摄取和降解。 菌体细胞表面疏水性高低将决定着烃类物质从胞外环境进入到胞内的难易［17］，因此，细胞表面疏水性越高，越有利于菌体细胞与烃类物质的黏附接触，进而促进菌株对烃类物质的降解［18］。那么，柴油降解菌株的选育过程中菌株细胞表面疏水性和降解率同样重要。 经梯度富集培养分离筛选得到一株高效柴油降解菌株YR2，经鉴定菌株应为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。 菌株YR2在1%、2%、4%、5%的柴油浓度下降解率分别为92.8%、60.8%、53.5%、41.0%。 菌株YR2对柴油乳化效果明显且稳定，菌株发酵液排油性能良好。菌株YR2具有较好的细胞表面疏水性，可分泌糖脂类表面活性物质。

【相关文献】 ［1］ 禄立彦, 邓超, 段作营, 等. 两株柴油降解菌的筛选和降解特性研究［J］. 工业微生物, 2012, 42（6）：14-20. ［2］ Lee M, Kim MK, Kwon MJ, et al. Effect of the synthesized mycolic acid on the biodegradation of diesel oil by Gordonia nitida strain LE31［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005, 100（4）：429-436. ［3］ 马晓焉, 陈德育, 段敏, 等. 柴油降解细菌的筛选及生长特性初探［J］. 西北农林科技大学学报, 2013, 41（6）：85-90. ［4］ Lee M, Woo SG, Ten LN. Characterization of novel diesel-degrading strains Acinetobacter haemolyticus MJ01 and Acinetobacter johnsonii MJ4 isolated from oil-contaminated soil［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28（5）：2057-2067. ［5］ Huang L, Ma T, Li D, et al. Optimization of nutrient component for diesel oil degradation by Rhodococcus erythropolis［J］. Marine Pollution Bulletin, 2008, 56（10）：