（一）基因突变类型（表型分类）
营养缺陷型（株）

选择性突变
抗性突变型（株）
条件致死突变（株）

非选择型突变
形态突变型（株） 抗原突变型（株）
产量突变型（株）

营养缺陷型——因突变而丧失合成某种 物质的能力，因此必须在培养基中添加 某种物质才能生长的突变类型。
抗性突变型——因突变而产生了对某种 化学药物或致死物理因子的抗性的突变 株。

（二）诱变育种
诱变 + 筛选 诱变是随机的；筛选是定向的 目前发酵工业生产菌株都是经 过突变改造过的。
1、诱变育种的基本规律
2、诱变育种中的几个原则
诱变剂的选择 诱变基本过程 诱变剂剂量的选择 诱变剂的处理方法


突变株的筛选
（1）诱变剂的选择
诱变剂作用的普遍性：
在其它菌种选育中诱变效果好的诱变剂。 如：UV 亚硝基胍（NTG），快中子
影印检出法
夹层培养法
限量补给法
在含少量的（ 0.01% ）蛋白胨的 MM 上培养, 大菌落为野生型 小菌落的为缺陷型。

C-4:鉴定缺陷型
生长谱法 组合营养物法 组 合 补 充 培 养 基 法

生长谱法

斜面菌种-----生理盐水洗下细胞-----洗涤-----涂布（105个/皿）
纸片1:氨基酸混合液; 纸片3: 核酸水解液;

突变是独立的。某一基因 发生突变不会影响其它基 因的突变率。
（三）基因突变的特点
以细菌的抗药性为例。
不对应性：突变的性状与突变原因之 间无直接的对应关系。 自发性：突变可以在没有人为诱变因 素处理下自发地产生。 稀有性：突变率低且稳定。
独立性：各种突变独立发生，不会互 相影响。 可诱发性：诱变剂可提高突变率。
第四节发酵工业菌种改良
菌种改良技术的进步是发酵工业发展的技术支撑。 所以，育种工作者的任务就是在不损及微生物基 本生命活动的前提下，采用物理、化学或者生物 学以及各种工程学的方法，改变微生物的遗传结 构，打破原有的代谢机制，使之成为“浪费型” 菌株。同时，按照人们的需要和设计安排，进行 目的产物的过量生产，最终实现产业化的目的。
孢子悬液------诱变----适当培养（表型迟）涂布平板----打孔取菌落-----琼脂块培养4 -5天—
测定琼脂块所含的抗生素的抑菌圈----效价高菌
（2）抗药性突变株的筛选（梯度平板法）
抗药性突变株的应用：
*作为菌株的遗传标记 *作为生产菌种
（结构类似物抗性突变株）
如“吡哆醇高产菌株的筛选”
诱变剂的特异性：经验之谈
四环素族抗生素用亚硝酸、羟胺， 青霉素用氮芥、乙烯亚胺、亚硝基胍．
菌株的差异：（即使是同一菌） A：遗传性不稳定的菌株-----用缓和诱变剂 B：遗传性稳定的菌株----首用强，后用缓。 考虑诱变机制： UV 嘧啶， 亚硝酸 嘌呤，因此复合用为好
（2）诱变基本过程
选择合适的出发菌株

一组：1 二组：2 三组：3 四组：4 五组：5
2 6 7 8 9
3 7 10 11 12
4 8 11 13 14

5 9 12 14 15


1）每组内无重复的营养因子 2）每组中应包含只出现一次的因子 3）每组中其他因子应分别出现二次
组合营养物法：
组合补充培养法



如是多个缺陷型菌株， 则制成各营养组合平板，将待测菌 株依次点接到这一组平板的对应位 置上， 根据在各平板上的生长情况逐个分 析各菌株的缺陷型 MM+A +B +C +A+B +A+C
（3）营养缺陷型(auxotroph)的筛 选
A：有关的三类遗传型个体：
营养缺陷型突变株： 野生型菌株： 原养型菌株：
B 有关的三类培养基

基本培养基（MM）[-]：凡是能满足野生型菌
株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基（CM）[+]：满足一切营养缺陷型 菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基（SM）[x]：在MM中有针对性地


加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型
菌株生长的合成培养基。
C 营养缺陷型的筛选步骤
C-1：诱变处理（同前讲述） C-2 ：淘汰野生型（ 浓缩缺陷型 ） C-3：检出缺陷型 C-4：鉴定缺陷型
C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷 型）
（1）抗生素法
野生型菌株在MM上生长 +青霉素—杀死Ｇ＋ 缺陷型菌株在MM上不生长 ＋青霉素—-不杀死
↓ 制备待处理的菌悬液 ↓ 诱变处理
↓
筛选
↓
保藏和扩大试验
出发菌株的选择

出发菌株应具备
①对诱变剂的敏感性高； ②具有特定性状的生产能力
◆出发菌株的来源 ①自然界分离到的野生型菌株： ②历经生产考验的菌株： ③已经历多次育种处理的菌株：
制备单细胞或单孢子悬液

要求 ①菌体处于对数生长期， ②细胞分散且为单细胞， 方法：① 玻璃珠打散10-15min; ② 加０.3%吐温80 ③ 用无菌脱脂棉过滤。 制备：物理诱变剂——生理盐水 化学诱变剂——缓冲液 浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml
（3）诱变剂剂量的选择

用 50—85% 的杀菌剂量，此 时正突变率高，特别是出 发菌株已是高产菌株
诱变剂的剂量对产量变异影响的可能结果
a.未经诱变剂处理；b.变异幅度扩大，但正负突变相等； c.正突变占优势；d.负突变占优势
（4）诱变剂的处理方法
诱变剂使用方式 单一处理 复合处理 诱变处理条件： 温度（生长温度） PH（缓冲剂） 处理时间 诱变作用的终止：用解毒剂、用水稀 释
稳定性：变异性状稳定可遗传。
可逆性：正向突变率=回复突变率
（四）基因突变的机制
自发突变 诱发突变

二、突变与育种
（一）自发突变与育种 1、生产中育种 10-6突变率 ---寻找正向突变菌株 2、定向培育优良菌种 牛型结核杆菌------13年----230 代----卡介苗（减毒活菌疫苗）
（5）突变株的筛选
筛选条件：基因型+环境=表型 表型迟延 充分表 达
分离性迟延现象
生理性迟延现象
（5）突变株的筛选
合适的筛选方法 ： 平皿快速检测法 变色圈法 透明圈法 抑菌圈法 梯度平板法 生长圈法
摇瓶培养法
第一轮：
诱变处理
初筛
（每瓶一株）
一个出发菌株→→→ 选出200个菌株→→→ 选出50株


制霉菌素法则适合于真菌
抗生素处理完 后，离心收集 细胞，并转入 低渗溶液
（2）菌丝过滤法
适于：丝状（放线菌、霉菌）
原理： 野生型基本培养基上发育成菌 丝； 缺陷型孢子不萌发可通过滤膜， 野生型菌丝不能通过。
C-3:检出缺陷型
逐个检出法 影印检出法 夹层培养法 限量补给法

逐个检出法
纸片2:维生素混合液; 纸片4: 酵母水解液
组合营养物法：
A 将多种营养因子编组；
b. 将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养； c. 结果分析； 一组：1 二组：2 三组：3 四组：4 五组：5 2 6 7 8 9 3 7 10 11 12 4 8 11 13 14 5 9 12 14 15
复筛
→→→选出5株 （每瓶四株） 40株 复筛 40株 初筛 诱变处理 5个出发菌株→→→ →→ → 选出50株 →→ →选出5株 40株 第二轮： 40株 （每瓶一株） 40株 （每瓶四株）
3、三类突变株的筛选
产量突变株筛选 抗药性突变株的筛选 营养缺陷型的筛选

（1）产量突变株筛选
琼脂块培养法（春日霉素）
目的
防止菌种退化
解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量 开发新产品
方法
基因突变： 自然选育、诱变育种
基因重组： 杂交、原生质体融合、基因工程 基因的直接进化： 点突变、易错PCR、DNA Shuffling等
一、基因突变
突变：指生物体的表型发生的可遗 传的变化。 狭义突变：基因突变—点突变 广义突变：基因突变和染色体畸变 -6 突变的几率：10 ---10-9 野生菌株 ---突变-----突变株

条件致死突变型——突变后在某种条 件下可正常生长繁殖，而在另一条 件下却无法生长繁殖的突变型
抗原突变型——因突变而引起的抗原 结构发生改变
（二）突变率




每一细胞在每一世代中发生某一性 状突变的几率。 突变率为10–8是指该细胞在一亿次细 胞分裂中，会发生一次突变。 突变率也可以用每一单位群体在每 一世代中产生突变株 突变率=突变细胞数/分裂前群体细 胞数