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。有学
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者将淋巴细胞作为观察的靶细胞 , 同样应用细胞增生 实验的方法 , 便可观测 EEDs 对免疫系统的影响 。 细胞增生实验中最常用的细胞数检测方法为噻唑蓝 ( MTT )比色法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥 珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫 色结晶甲瓒, 并 沉积在细胞中。在一定细胞 数范围 内 , MTT 结晶形成的量与细胞 数成正比。用 有机溶 剂二甲基亚砜溶解细胞中的甲瓒 , 再用酶联免疫检测 仪在 490nm 波长处测定其光吸收值, 便可间接反映 活细胞数量 。 ( 3) 酵母筛选实验 : 酵母筛选实验 的基本方法是利用分子生物学技术将激素效应元件 的基本序列插入报告基因的上游 , 将报告基因置于基 因重组酵母细胞激 素受体的调控之下。当 EEDs 作 用于酵母细 胞时, 会使特定 的激素受体发生 变构效 应 , 进而激活激素效应元件 , 使报告基因得以表达 , 其 表达量与 EEDs的污染程度具有剂量效应关系 , 于是 便可通过检测报告基因的表达量反映 EEDs 的类激 素作用。重组基因酵母筛选法因其快速、 灵敏、 简易、 廉价、 和高通量等优点而成为较为广泛应用的 EEDs 筛选实验方法之一
环境内分泌干扰物 ( environm enta l endocrine dis ruptors, EEDs) 是指干扰生物体内维持内稳态及调节 生殖、 发育过程的天然激素的合成、 释放、 运输、 代谢、 结合、 以及消除等作用的外源性物质 , 又名内分泌干 扰化合物 ( endocrin e disrupting che m icals, EDCs) 、 环 境激素 ( env ironm ental hor m ones) 等 。其来源主要 是除草剂、 杀虫剂、 防腐剂、 杀菌剂、 塑料增塑剂、 洗涤 剂、 化妆品、 阻燃剂以及化工副产品等人类生产生活 当中接触到的多种化学制品。随着人类社会现代化 进程的不断加 快, 进入环境中 的化学性物质 越来越 多 , EEDs 对人类的影响也日益突显。 20 世纪 90 年 代以来 , 已有大量的研究资料表明, EED s与人类生殖 障碍、 发育异常、 代谢紊乱及某些癌症 ( 如乳腺癌、 睾 丸癌、 前列腺癌等 ) 的发生密切相关, 严重影响人类 健康。 EEDs现已受到学术界和公众的广泛关注, 成 为当今生物学、 医学、 环境科学、 农学、 毒理学等多领 域研究的热点。在众多有关 EED s的研究当中 , 应用 实验方法进行的研究因为可探讨的问题范围广 , 科学 论证强度高 , 可操作性强, 形式多样等特点 , 已成为目
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是一种灵敏、 快速、 高效的 EEDs筛选方法, 其原理是 利用基因工程技术, 通过将已知的顺式调控序列即反 应元件剪接到报告基因的上游以控制报告基因的表 达并构建出基因重组质粒 , 转染至宿主细胞内。当环 境化学物作为细胞外信号与反应元件所对应的特定
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JM ed R es , Jan 2011, V o . l 40 N o . 1
竞争性结合实验的原理是雌激素与雌激素受体的结 合引起雌激素反应, 通过体外测定外源性化学物与 雌激素受体的亲和力即可初步判定其类雌激素活性。 其基本过程包括从组织中分离雌激素受体 , 而后用已 知的外源性化学物同放射性标志物标记的雌激素的 竞争性替换实验来评估该外源性化合物的雌激素效 应等级。需要说明的是, 本方法只能表明某种外源性 化学物与雌激素受体的结合能力 , 不能反映其在生物 [ 8] 体内的代谢情况及对受体的 激活能力 。 ( 2) 细胞 增生实验: 细胞增生实验是通过检测靶细胞在指数增 长期接触受试物后的细胞增生数反映受试物生物学 效应的实验方法。目前最常用的是 的 E - screen 试 验 , 又称人乳癌 细胞 ( MCF - 7) 增生实验。 MCF - 7 是激素依赖性细胞系 , 雌激素可诱导该细胞的细胞增 生。 E - screen试验的基本方法是用活性炭 - 葡聚糖 处理实验动物血清, 以去除雌激素, 而后比较在含有 10 % 处理后血清的培养液中 , 加和不加雌激素以及不 同浓度的类雌激素物质培养后的细胞数量
Ideas and M ethods of E xperim enta l Study on E nv ironm enta l E ndocrine Interferents .
China A cademy of Chinese M ed ical S ciences , B eijing 100053, Ch ina Abstrac t Env ironm enta l endocrine interfe rents , because of the ir w idespread presence in the env ironm ent and hum an health haz a rds , has no w becom e a research ho t po int in m any scien tific fie lds . Exper i m enta l study , as one of the m a in fo r m s o f sc ientific research, has p layed an i m portant ro le in re lated stud ies on env ironm enta l endocr ine interferents . W ith literature / docum ents and sc ientific practice , the research ideas and m ethods o f screening , detection, contro,l treatm ent , and the mechan ism of tox ic ity o f the env ironm enta l endocr ine interferents we re discussed in th is pape r for gu idance of the sc ientific research o f env ironm en tal endocrine in terferents. K ey word s Env ironmenta l endocr ine interferen ts ; Exper i m ent ; Ideas and m ethods ; R ev ie w
医学研究杂志
2011 年 1 月
第 40 卷
第 1期
∀ 综述与进展 ∀
环境内分泌干扰物实验研究的思路与方法
倪
摘 要
青
姜
山
环境内 分泌干扰物因其在环境中的广泛存在和对人类健康的危害而受到广泛关注 , 现已成为多个科学 领域的研究
热点。实验研究作为科学研究 的主要形式之一 , 在环境内分泌干扰物的相关研究中 发挥着重要作用。本文结合文献 资料和科学 实践 , 对环境内分泌干扰物的筛选、 检测、 控制、 处理、 毒性观察以及作 用机制等 方面的研究 思路与方 法进行 论述 , 以期指 导环境 内分泌干扰物的科学 研究。 关键词 环境内 分泌干扰物 实验 思路与方法 述评 N i Q ing, J iang Shan. Guang ! AnM en H o s p ital of
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( 2007BA C03A 11 , 2007BA C03A 11- 07) 作者单位 : 100053 北京 , 中国中医科学院广安门医院
∀ 综述与进展 ∀
( 1) 子宫增重法: 子宫增重法是用来评价外源化 学物的雌激素活性的传统体内实验方法, 其原理是雌 激素具有促进子宫内膜增生变厚而导致子宫增重的 生理效应。基本过程是选用大鼠或小鼠等啮齿类动 物 , 摘除卵巢后, 以暴露前后子宫重量以及子宫和体 重比值的变化等为指标 , 测定某种外源化学物是否 具有促进子宫 生长的作用, 以 此来评价其雌 激素活 性 。这种实验直接作用于雌激素效应器, 可以直 接显示化学物的雌激素样功能, 结合了内分泌系统的 各个方面 , 考虑了化学物的吸收、 代谢、 分布和排泄, 同时也考虑了影响内分泌的其他途径。但反应的灵 敏度、 反应性和实验终点的测定易受到个体差异、 动 物饮食和操作规范程度等因素的影响。 ( 2) 体内生物标志物法: 生物标志物是指反映机 体与环境因子物理的、 化学的或生物的交互作用所引 起的所有可测定的改变, 包括生化的、 生理的、 行为 [ 5] 的、 免疫 的、 细胞的、 遗传的等多方面的改变 。目 前所得的 EEDs 生物标志物基本上 是针对水生态环 境的, 以环境雌激素生物标志物研究较为成熟, 其中 一些生物标志物如卵黄蛋白原、 卵壳蛋白等已得到广 泛应用。卵黄蛋白原 ( V tg ) 是指示环境雌激 素暴露 最为敏感的分子生物标志物之一。 V tg 为 卵黄蛋白 的一种前体。成熟雌鱼体内的雌激素能够作用于肝 脏中的雌激素受体, 使肝脏合成 V tg。通过血液的运 输 , V tg 便 可到达卵 巢, 作 为卵黄 蛋白的 营养支 持。 雄鱼和幼鱼在正常情况下不合成 V tg , 但其肝脏中也 存在雌激素受体 , 于是在环境雌激素的作用下雄鱼和 幼鱼就可以 产生 V tg, 而由 于没有 卵巢有 效地 清除 V tg, 血液中 V tg 浓度会升高。因此 , 雄鱼和幼鱼体内 生成的 V tg 水平的变化可以作为一个敏感的环境雌 激素暴露指标。像卵黄蛋白原一样 , 卵壳蛋白 ( Z rp) 也是雌鱼在性成熟期受分泌的雌激素刺激 , 在肝脏诱 导合成的。通过血液循环系统 , Z rp 被运输到卵巢构 建卵壳。 Z rp是一种比 V tg 更灵敏的指示环境雌激素 暴露的 生 物标 志 物。 目前 , 经济 合 作 与发 展 组 织 ( OECD )已将 V tg 作为检测环境雌激素化学 物质的 生物标志物 , 且多将 V tg 和 Z rp 联合应用。测定 V tg 和 Z rp的方法主要是免疫印迹法和 EL ISA 法