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Biolog 自动微生物分析系统主要根据细菌对糖、醇、 酸、酯、胺和大分子聚合物等95 种碳源的利用情况 进行鉴定。 细菌利用碳源进行呼吸时,会将四唑类氧化还原染色 剂( TV) 从无色还原成紫色，从而在鉴定微平板上形 成该菌株特征性的反应模式或“指纹图谱”。 通过纤维光学读取设备——读数仪来读取颜色变化, 由计算机通过概率最大模拟法将该反应模式或“指纹 图谱”与数据库相比较，将目标菌株与数据库相关菌 株的特征数据进行比对，获得最大限度的匹配,可以 在瞬间得到鉴定结果，确定所分析的菌株的属名或种 名。
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（1）基内菌丝与培养基结合紧密，不易挑起； （2）菌落边缘有辐射的菌丝，称为辐射状菌丝； （3）生长后期表面形成紧密的绒毛状或坚实、干燥、 不透明、多皱的表面，上面常有一层色彩鲜艳的干粉； （4）可形成絮状或颗粒状的典型菌落，菌落的正反面 颜色往往不一致，菌落边缘培养基的平面有变形现象； （5）有特殊气味（土霉气味）等。
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1、经典技术和方法——直接观察测定

利用显微镜对样品中的微生物直接观察
计算数目，测定丝状微生物长度（普通染色、荧光 染色）
优点：直接观察天然样品中微生物的形态和微生物 所处的位置 缺点：样品量少，代表性差


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HeLa cells showing negative staining by ICC/IF using only secondary antibody. The cells were 100% methanol fixed (5 min) and then incubated in 1%BSA / 10% normal goat serum / 0.3M glycine in 0.1% PBS-Tween for 1h to permeabilise the cells and block nonspecific protein-protein interactions. The secondary antibody (red) was ab150091 Alexa Fluor® 647 goat anti-rabbit IgG (Fc) used at 2µ g/ml for 1h. DAPI was used to stain the cell nuclei (blue) at a concentration of 1.43µ M.
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陈声明，林海萍，张立钦主编，微生物生态学导论， 高等教育出版社，2007 池振明主编，2005，现代微生物生态学，科学出版社 杨家新主编，2004，微生物生态学，化学工业出版社 宋福强主编，2008，化学工业出版社 张素琴著：2005， 科学出版社 Molecular Microbial Ecology, A. Mark Osborn & Cindy J. Smith, Taylor & Francis Group, 2005

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Microbial Ecology Applied and enves in microbial ecology ISME Journal Applied Microbiology and Biotechnology FEMS Microbiology Ecology Frontiers in Microbiology Geomicrobiology Journal Nature Microbiology Review
Hep G2 Cells Stained Using the LIVE/DEAD® Cell Imaging Kit, showing green-fluorescent live cells and redfluorescent dead cells.
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FISH技术
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1、经典技术和方法——培养研究

优点：能对活的微生物进行计数，并能区分真 菌、放线菌和细菌 缺点：可培养率很低<1%; 单菌落是否由一个 细菌繁殖而来；丝状微生物菌落究竟是由孢子 而来还是由菌丝而来难以区分
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稳定性同位素探针( stable isotope probing ,简称SIP) 要先将标记 的底物13C(或15N) 添加到系统中,然后再提取微生物群落DNA，用 梯度离心法把重的DNA (被13C或15N 标记) 和轻的DNA (未被13C 或15N 标记) 分开。用群落DNA 分析方法分别对重DNA 和轻DNA 进行分析,可以了解活性和非活性微生物群落,从而知道哪些微生物 在起作用。 SIP 技术非常明显的优点是可以明确群落中实际起作用的微生物,但 也有一些缺点。如不易检测数量很少但活性很高的微生物的活性; 鉴于DNA中要求N 的含量相对较低，SIP 技术比较适合研究与碳 素转化有关的活性微生物群落。
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培养时间 (h)
浅层含水层沉积物中微生物群落培养过程中AWCD的变化
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赵锐等，2010
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赵锐等，2010
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赵锐等，2010
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磷脂类化合物只存在于细胞膜中，不同微生物其磷 脂脂肪酸组成和含量都不相同。 一旦生物细胞死亡，其中的磷脂化合物马上降解。 因此该方法十分适合于微生物群落的动态监测。
Archaea in the picture in red, sulfate reducing Bacteria in green. Credit: Annelie Pernthaler/UFZ
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1、经典技术和方法——培养研究


对采集的样品进行稀释、培养
辨认培养物的种类
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微生物生态学？
研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相 互关系的一门学科
关注的内容：主要研究微生物的分布、种群组成、 数量和活力等与环境的关系，以及微生物之间、 微生物与高等有机体之间的相互关系。
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1、经典技术和方法 直接观察测定 培养研究 2、生理生化方法 3、分子生物学方法 4、稳定同位素方法
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什么是微生物生态学？ 微生物生态学的研究方法有哪些？ 每种方法的优缺点是什么？举例说明
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氨氧化 NH3+→NO2- →NO3- 硝化作用 amoA（功能基因） 氨氧化细菌（AOB）, 氨氧化古菌（AOA）
土壤呼吸测定仪
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代谢活力研究 优点：能确定样品中微生物能做什么； 缺点：无法说明样品究竟是哪些微生物 在起作用，样品存在哪些微生物种类和 微生物在自然样品中的分布情况

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Biolog微平板法 PLFA图谱分析
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Biolog 微生物自动分析系统是美国Biolog 公司从 1989 年开始推出的一套微生物鉴定系统，最早进入 商品化应用的是G-好氧细菌鉴定数据库(GN) ,其后陆 续推出G+好氧细菌( GP) 、酵母菌( YT) 、厌氧细菌 (AN) 和丝状真菌(FF) 鉴定数据库。 Biolog 系统6101 版数据库共包括1973 种微生物， 其中细菌234 个属，1 226 个种，与其他鉴定系统 相比，其微生物种类的数据量较大，适合于环境、食 品、工业、临床和动植物病原菌的鉴定分析。
3、分子生物学
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3、分子生物学方法
◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ (G+C)摩尔百分含量 核酸探针杂交技术 DNA-DNA杂交 DNA序列分析 基因芯片 宏基因组学 基于PCR的指纹图谱分析
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周继中 Oklahoma
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代谢活力研究：放射性/稳定 同位素标记记某种代谢物， 测定代谢活力
◦ C14， C13， H3， N15

酶活性测定
ATP含量测定：ATP仅存在 于活的细胞中，且在细胞中 的含量基本一致
ATP检测仪
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代谢活力研究

叶绿素含量测定：估计藻 类和光合细菌的生物量和 代谢活力 土壤呼吸速率测定：间接 估计土壤中的生物量，不 适于仅有厌氧呼吸或发酵 的微生物测定

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经典的观察和培养方法能够在一定程度上告诉我们 样品中微生物的数量、可培养微生物的数量及类型。 但这些结果不能告诉我们微生物在样品中能干什么？

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包括用于微生物生物量测定的氯仿熏蒸方法、底物 诱导呼吸法和光合微生物色素法等； 用于测定土壤C矿化速率和微生物呼吸强度等方法； 用于测定土壤中物质转化的生物活性和酶活性的分 析方法； 测定微生物能量代谢的分析方法等
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3、分子生物学方法
◦ 基于PCR的指纹图谱分析
DGGE/TGGE