第二章放射性示踪的标记技术第一节放射性标记的基本知识•天然放射性核素，半衰期比较长，比活度较低，分布分散而且品种有限。

•人工放射性核素，可用核反应堆、加速器和核素发生器生产，其原始状态通常都是无机盐类。

例如Ba14CO3，NaH232PO4，45CaCl2，59FeCl3•14C、3H、32P、35S和125I等作示踪原子，并且要把它们做成与体内物质相应的有机化合物而开展示踪研究。

标记化合物的概念•凡是分子中某一原子或某些原子（或基团）被放射性核素或稳定核素所取代，而成为一类易被识别的化合物，则称之为标记化合物。

标记化合物的分类1．同位素标记化合物（isotopic labeled compound）化合物中某元素的稳定同位素原子被同一元素的放射性同位素或稳定同位素原子取代，取代前后的化合物在理化性质上完全相同（同位素效应除外），这类标记称为同位素标记（isotopic labeling）。

2．非同位素标记化合物（nonisotopic labeled compound）该类标记化合物是用化学性质相似或根本不同的放射性核素取代原化合物中所含的某元素的稳定核素原子。

这种标记称非同位素标记（nonisotopic labeling）。

标记化合物的命名•有机标记化合物的命名，通常先指出标记位置，再列出标记核素，最后是化合物的名称，如l-14C-醋酸。

•无机标记化合物命名，通常在化合物的前面注明放射性核素，也可把标记核素直接写在分子式内，如125I-碘化钠（125I-NaI）或Na125I。

标记化合物的分型•l. 定位标记S（specific labeling）•它是指放射性核素只局限于标记化合物分子中某一特定的位置上，而在其他位置上的同种原子就不具有放射性。

常用“S”表示，如1-14C（S）-乙酸或1-14C-乙酸，表示第1位碳原子被放射性14C标记。

• 2. 准定位标记n（nominal labeling）•在3H标记中，理论上应获得预期的定位标记分子，实际上，3H在预期位置上的分布，有时低于化合物中3H总量的95％，或百分比值不详。

此类标记称准定位标记，用“n”表示。

这是一种名义上的定位标记，因此，也称名义定位标记。

标记化合物的分型• 3. 均匀标记U（uniform labeling）•是一种非定位标记（non-specific labeling），常用于14C标记的化合物中。

它是指整个分子中某元素所有的原子均可能被放射性同位素取代，取代的几率是相等的，而且放射性原子在分子中的分布是均匀的，达到统计学上的均一性。

• 4. 全标记G（general labeling）•它是指化合物中某种原子不管在什么位置上都可能是带放射性的。

全标记主要用于3H标记的化合物，在化合物分子中，任何有氢元素的位置上，都可能被氚所取代。

但是由于各个氢原子在分子中的位置不同，在标记制备过程中被氚取代的几率不同，不具有统计学上的均一性，因而全标记的化合物往往是全而不均的。

标记化合物的分型• 5. 双标记或多标记（double labeling or multiple labeling）•在生物学示踪实验中，有时需要在化合物分子中引入两种或两种以上元素的同位素，或引入一种元素的两种或两种以上的同位素原子，这种标记化合物称为双标记或多标记化合物。

例如15NH214CH２COOH（氨基乙酸）第二节放射性标记的基本方法•1．标记核素的选择•（1）合适的核性质：γ射线；半衰期；比活度；•（2）得到的产物与被示踪化合物性质应尽量接近；•（3）标记方便，标记的化合物稳定放射性核素标记的基本方法•2．核素标记的要求：•（1）放射性核素标记率应尽量高，未标记的核素应注意回收利用。

•（2）放射性核素标记需用微量或超微量方法进行标记、纯化和鉴定。

•（3）尽量减少放射性核素的稀释，避免加入不必要的载体；•（4）最好用同位素标记。

如使用非同位素标记，则标记位置应以不影响标记分子的特定功能为佳；•（5）标记过程应简单、快速。

最好在标记的最后阶段加入核素，以减少损失和污染；有条件时，在标记前作冷实验，以取得经验。

放射性标记基本方法•1．化学合成标记法（chemical synthesis）•此方法是通过化学反应将放射性核素引入化合物中。

换言之，就是将放射性核素的初始原料，通过选定的工艺步骤，合成所需要的标记化合物。

此法不仅比活度高，而且能够定位标记，但合成步骤较多。

14C、3H和放射性碘标记化合物常用此法进行合成标记。

这类标记化合物已广泛用于药理、代谢和分子的化学结构等方面的研究。

对于需要制备的标记化合物来说，当然是已知结构的物质。

•化学合成标记法（chemical synthesis）•注意以下几个问题：•（1）必须注意操作量与比活度的关系对生物学示踪实验来说，使用的标记化合物的量愈少，愈接近于生物体的正常生理状态。

但另一方面，示踪物质进入生物体以后，要受到大量正常物质的稀释，需要使用的标记化合物的比活度愈高愈好。

1. 化学合成标记法•（2）必须有较高的反应产物。

因为有机反应常常伴随许多副反应产物。

较高的反应产物一方面使原料的利用率高，更主要的是减少了样品中的放射性杂质。

•（3）标记化合物必须在完全密封的系统内有机合成因为所有的标记化合物的合成都要从简单的放射性无机盐类开始，大部分中间产物都是低分子量的放射性气体或者挥发性液体，为了安全防护和防止物料损失，一般反应要在“真空线中”进行。

2．同位素交换标记法（isotope exchange）•同位素交换标记法是利用同一元素的放射性核素与化合物中的非放射性核素之间的交换反应来制备所需要的标记化合物。

该方法操作快速、简便。

在放射性核素半衰期短、化学合成步骤多的情况下，该方法的实用意义更大。

适用于大量有机化合物、天然产物或难以制得前体的标记化合物的制备，是制备3H标记化合物的重要方法。

•同位素交换法包括酶促合成法、催化交换法和气体曝射法。

2．同位素交换标记法（isotope exchange）•（1）酶促合成法•在酶的催化下，可以合成某些特殊的标记化合物，例如γ-32P-ATP的合成常用此法。

•反应机理是利用非放射性的腺苷三磷酸在3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的催化下，使腺苷三磷酸γ位上的磷酸与磷-32标记的无机磷酸盐之间进行同位素交换反应。

2．同位素交换标记法（isotope exchange）•（2）催化交换法•常用于氚标记化合物的制备。

将欲标记的有机化合物和催化剂（常用PdO-BaSO4或者Pd-C）置于溶剂中，通入氚气，室温搅拌数小时后竟分离纯化后即可得氚标记的化合物。

此法可制备氚标记的氨基酸、嘌呤类核苷和核苷酸、激素等。

•液相的催化交换法是将待标记物溶解在氚水（3H2O）中，用钯、铂作催化剂，在一定pH值和温度下，置特定的真空系统里进行氢和氚的交换反应。

2．同位素交换标记法（isotope exchange）•（3）气体曝射法•将需要标记的有机化合物置于比活度很高的氚气中，密封放置几天至几星期，使氚气中的氚与有机化合物中的氢原子发生交换反应而制得氚标记化合物。

•可用高频放电、微波、紫外线、γ射线照射等促使氚气电离，或者在反应中加贵金属作催化剂，使交换标记过程加速。

3．生物合成标记法（biosynthesis）•该方法是利用酶、微生物、动植物的生理代谢过程，引入放射性核素合成有机化合物。

特别是对目前尚不能用人工方法合成的有机化合物，如某些激素、蛋白质、抗生素、核酸、维生素等，可用生物合成法制备。

•生物合成法比化学合成法容易，能够从自然界直接获得有生物活性的异构体。

•生物合成的缺点是产额低，标记位置不易控制，易造成类似标记物，增加了标记的分离和提纯的难度。

•生物合成法可分为两类：全生物合成法和酶促合成法（enzymatic synthesis method ）。

3．生物合成标记法（biosynthesis）•（1）全生物合成法它是利用完整的生物或其某一个器官的生理代谢过程来进行标记。

如生物合成氨基酸、糖和核酸均为全生物合成。

常用的生物有细菌、藻类、酵母等低等生物，它们容易在实验室中培育，代谢旺盛，繁殖迅速，因而制备效率高。

3．生物合成标记法（biosynthesis）•（2）酶促合成法•它是利用生物组织中某种特定的酶，促进标记前体物质的合成反应，生成所需的标记产物。

在酶的催化下，可将放射性核素结合到生物分子上。

•该方法合成的标记化合物很多是具有旋光性的异构体，产物不必经过分离。

因此，酶促合成法也可看作是应用特殊催化剂的化学合成法。

例如，应用3H、32P、35S等核素标记的核苷酸类就属于酶促合成法。

常用标记化合物及其制备•1．放射性碳的标记化合物•生物医学中用得最多的是14C和11C。

•14C半衰期为5730年,半衰期长，能保证连续实验，又不需要进行放射性衰变校正。

•只发射β-粒子（0.159MeV），用液闪测量很方便；•外照射较弱，易防护；用于自显影时，影像清晰；•14C标记化合物的放射性比活度可高达2308.8MBq／毫克原子，丰度可达100％（商品达80％以上）；•14C可定位标记，纯化方便。

•与3H相比，14C标记化合物辐射自分解速度低；•由于构成物质的C－C键比较牢固，标记化合物中的14C原子也比较稳定。

1．放射性碳的标记化合物•由反应堆生产的14C为Ba14CO3，放射性碳的标记常从最简单的化合物（如11CO2或Ba 14CO3）为原料，先制备出一批基本的“钥匙”化合物，然后逐步合成得到更复杂的所需的产品。

•14C标记化合物制备工艺复杂，要求设备条件高和防护措施全。

一般放射性实验室从事14C标记有一定的困难。

•14C标记化合物的制备方法，基本上分为化学合成法、生物合成法和辐射合成法三类。

（1）14C标记化合物的有机合成•以Ba 14CO3为起始物制备14C的标记化合物可通过以下三条途径：•①通过14CO2合成•②通过14C–氰化钠（Na14CN）合成•③通过14CH≡14CH合成（2）14C标记化合物的生物合成•将某一植物放在充满14CO2的密闭室里，用强光照射时，叶子进行光合作用。

几个小时以后，叶子中已合成了标记的葡萄糖、淀粉和其他化学成分。

•如果植物的量足够多，根据需要可进行分离提取，有些标记的药物就是这样制备出来的。

•用这种生物合成的方法，可以准确地制备某种具有生理活性的旋光异构体。

2．3H标记化合物•在生物学示踪实验中，氚的重要性仅次于14C 。

氚标记化合物有许多突出的特点：•（1）氚的半衰期为12.35a，故有充裕的时间制备标记化合物和从事示踪研究。

•（2）氚的比活度高，可达1077.44GBq／毫克分子，比较容易获得高比活度的标记化合物。