免疫金的特性胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。
用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。
胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。
胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。
因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。
来源：Gold 2免疫金的制备1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。
原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。
但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。
在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞pH计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇（PEG，20000）稳定胶体金后，再调胶体金的pH 值。
2．将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应2～5min。
由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。
3．加入浓度为0.2％的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。
4．离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。
离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm 金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。
5．轻吸上清液。
沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。
如此洗涤2～4次。
以彻底除去未结合的蛋白质。
6．免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。
稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。
缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。
多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。
稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。
稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。
免疫胶体金制备１、蛋白质的处理：由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。
必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
２、蛋白质最适用量的选择：将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到1ml 胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1 ml 10％NaCl 溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。
３、标记：在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。
下述标记步骤最为常见：①用0.1mol/L K2CO3 或0.1mol/L HCl 调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。
②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为2～3ml），搅拌2～3分钟。
③加入5ml 1％PEG20000 溶液。
④于10000～100000g 离心30～60 分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸去上清液（切忌倾倒）。
⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000 的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以Ａ1cm/540nm=1.5 左右为宜，以0.5mg/ml 叠氮钠防腐，置4℃保存。
⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200 柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1％B SA的缓冲溶液洗脱。
通常用IgG 包被的金溶胶洗脱液pH 为8.2，以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。
以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。
胶体金标记蛋白质的纯化纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。
其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。
（一）超迷离心法根据胶体金颗粒大小不同及蛋白质种类不同，离心的转速和时间也不同。
用牛血清白蛋白稳定的胶体金标记羊抗兔IgG,可先从低速离心（20nm颗粒用250g;5nm用4800g20min），弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀，然后将上清液5nm金标记物用60000g于4℃离心1h,20nm和40nm 金标记物用14000g于4℃离心1h.小心地吸出上清，将管底沉淀再用1%牛血清白蛋白缓冲液混悬至原量，平衡过夜后，重复离心2次，最后一次洗涤离心的沉淀，再用1%牛血清白蛋白缓冲液（含0.02mol/LNaN3）稀释到l:20.40nm金颗粒在520nm检验吸光度为0.35;20nm金颗粒为0.30;5nm金颗粒为0.25,用1%牛血清白蛋白缓冲液作空白。
制备的胶体金-蛋白探针可保存于4℃，如加入50%甘油可贮于0℃以下（-18℃）1年以上。
以聚乙二醇稳定的葡萄球菌A蛋白标记胶体金，按胶体金制备方法及所得颗粒大小不同，用不同离心转速分离纯化，以白磷还原法制备的5.0nm胶体金A蛋白，用125000×g离心；抗坏血酸法制备的11.3nm胶体金-A蛋白，用150000g离心45min,可见离心管底部附贴有小片紧密的沉淀，其上为较疏松的红色沉积物，再上为透明的上清液。
附贴管底的沉淀无用，以后操作步骤中不要搅起来，仍保持其贴于管底。
弃去上清液后，用等体积的0.0lmol/LPBS （pH7.2）溶解疏松红色沉积物，同上重复离心1次，小心移去上清液，剩余0.5ml上清液，将疏松红色沉积物溶解后，即为初步提纯的金标-A蛋白试剂。
（二）凝胶过滤法凝胶过滤法必须以BSA为稳定剂。
将前述胶体金-蛋白质复合物装入透析袋内，置硅胶中浓缩至原体积1/10左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，取出浓缩液，以15000r/min离心15min （或用上述离心法纯化后的胶体金，再进一步用此方法纯化）。
吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400（SephacrylS-400,Pharmacia公司产品，Sweden）色谱柱上分离纯化。
柱床高20cm,直径0.8cm,加样体积为柱床体积的1/10.用0.02mol/LTBS液（内含0.1%BSA,0.05mol/LNaN3,pH8.2者用于胶体金标记IgG,pH7.0者用于胶体金标记蛋白A）洗脱，流速为8ml/h,按红色深浅分管收集洗脱液。
可见先滤出的液体呈微黄色，有时略浊，内含大颗粒聚合物等杂质。
纯化的金标记蛋白滤出液随浓度增加而红色逐渐加深，清亮透明，此后为略呈黄色的未标记蛋白组分。
表中列出胶体金与蛋白质结合后，用离心法纯化的条件。
表6-8列出几种免疫金探针离心纯化的条件，仅供参考。
超迷离心转速与金颗粒直径的关系胶体金颗粒/nm pH 标记蛋白质离心力/g 时间/min5 9.0 羊抗人IgG 45000 4510 8.2 McAb 45000 3015 6.5 链霉亲和素120000 4520 6.0 SPA 120000 3010 9.0 羊抗兔IgG 120000 60来源：赵需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。
测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可. 蛋白与胶体金结合的最佳pH测定：取若干1.5ml的试管，分别加入1ml胶体金用K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；去96孔培养板，按pH从高到低分别将上述胶体金分别取100ul加入孔中，重复三次；每孔分别加入20ul浓度为10%的NaCl溶液，混合，室温下放置10min；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH。
最小蛋白用量的确定：光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。
根据胶体金颗粒的大小，OD在520～580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。
图5.2中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45μg/ml。
来源：胶体金标记的实验操作（1）蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。
如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1）待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。
2）待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。
标记IgG时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA 时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10。
由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。
由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。
必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
（2）蛋白质最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的确定1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。
2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml～50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。
对照管只加1ml稀释液。
3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。
4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。